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在荧光定量PCR检测实验中可以采用多种方法来进行基因的定量。定量的方法也取决于实验的目标。当实验者对待测样品中的核酸的具体拷贝数比较感兴趣时，可以选择JD定量。如果实验者关注的是实验样本与对照样本之间的倍数变化，无需精确测定拷贝数，则选择相对定量。目前相对定量方法适用于大多数基因表达研究，可分析对照样本和一个或多个实验样本中目的基因表达水平的上调或下调。

在此我们将详细介绍目前使用广泛且适用于基因表达研究的相对定量方法：2^-ΔΔCq法。首先相对定量也需要仔细规划，实验生成的数据是相对丰度，而非确切的基因拷贝数。

相对定量方法--2^-ΔΔCq

2^-ΔΔCq法是一种非常普遍的技术，它比较了包括对照样本 (如未处理或野生型样本) 和内参基因 (如看家基因表达) 在内的实验样本的结果。采用该方法，可根据检测样本和对照样本中内参基因的Cq来调整相同样本中的目的基因的Cq。ZH得出的ΔΔCq值可用于测定目的基因表达量的倍数差异。具体计算方法如下：

该方法要求内参基因和目的基因具有相一致的扩增效率，并尽可能接近100% 。确定扩增效率的方法是采用同样的样本进行梯度稀释，生成内参基因和目的基因的标准曲线（下图）。确定内参基因和目的基因的扩增效率是否在90-110%的范围内，且相互间效率偏差在5%以内。

内参基因的必要性

内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。理想的内参基因应该满足以下条件：

① 不存在假基因(Pseudogene)，以避免基因DNA的扩增；

② 高度或中度表达，排除低表达；

③ 稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；

④ 表达水平与细胞周期及是否活化无关；

⑤ 其稳定的表达水平与目标基因相似；

⑥ 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。

内参基因的评估，可通过geNorm、BestKeeper、NormFinder、RefGenes 等工具来评估，这是保证结果可靠准确的前提。其次可对候选的内参基因进行qPCR 实验做进一步的筛选。在不同样本中均稳定表达的内参基因，即比较各样品中Cq平均值以及Cq值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。

Azure CieloTM实时荧光定量PCR系统——相对定量示例

1、实验方法

方法:从组织中提取RNA，逆转录成cDNA，以SYBR Green法进行荧光定量检测。

试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

实验步骤:提取RNA→cDNA合成→设计特异性引物→qPCR扩增→结果分析。

2、结果计算

Step1:ΔCq值=目的基因Cq–内参基因Cq

Step2:ΔΔCq值=处理样品ΔCq–对照样品ΔCq

Step3:ZH计算出倍数关系: 2^-ΔΔCq值

3、相对表达量结果：

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在做qPCR实验时，我们经常会问：“你是做JD定量还是相对定量呢？”，而定量方法的选择是取决于实验的目标。JD定量可测定目标核酸分子的实际拷贝数，但也是最费力、最复杂的定量形式。此方法要求周密的实验方案和高度准确的标准曲线，常用于确定病毒滴度。

使用标准曲线进行JD定量

JD定量是通过样品的Cq值和标准曲线进行比较实现的。首先为了建立标准曲线，需要已知拷贝数浓度的标准品，对标准品进行5次以上的连续梯度稀释，将稀释的标准品进行实时荧光定量PCR扩增，ZH根据各样品的拷贝数浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，其中X0为起始模板量。然后将未知样本的Cq值与此标准曲线进行比较，确定其拷贝数浓度。

从图1可以发现，当模板起始浓度越大时，荧光达到阈值的循环数越少，即Cq值越小。反之，模板起始浓度越小时，Cq值越大。起始模板量的Log值与循环数Cq值呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，即可确定未知待测样本中目的基因的量。

如何选择标准品？

如前所述，生成JD标准曲线采用的模板将决定数据的准确度。所以使用与实验样本尽可能类似的目标模板，可优选有证的标准物质或参考物质。那么制备标准品的常见方法如下：

☑  DNA 标准品：目的靶点的PCR扩增片段或含有目的靶点的质粒克隆（图2）。

优点：易于生成、定量，可在适当的储存条件下维持稳定性。

缺点：无法进行qRT-PCR 的逆转录步骤，大大影响了反应效率。

PCR扩增片段：通过常规PCR进行目的片段扩增，回收纯化PCR扩增片段，可直接作为标准品，相对于质粒，PCR扩增片段不是那么稳定。

质粒克隆：将目的片段进行PCR扩增，回收目的条带后连入T载体，再进行质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用。

☑  RNA 标准品：目的靶点的体外转录RNA(图3)

优点：结合了RT效率，ZDCD地模拟了目的靶点。

缺点：需要耗费时间生成该标准品，因其不稳定，难以保持长期准确度。

体外转录RNA：利用实时荧光定量PCR生成的PCR 产物可利用包含5’ T7启动子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆转录引物重新扩增。体外转录反应生成多聚腺苷酸化正义mRNA。纯化后可将其准确定量并稀释，用于生成标准曲线。

Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统——JD定量示例

1、实验方法：

•方法:从组织中提取基因组DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

•试剂:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•标准品:质粒标准品浓度为10⁶、10⁵ 、10⁴ 、 10³ 、10²、10¹；3个重复；设阴性空白对照

•实验步骤:提取gDNA→设计特异引物探针→qPCR扩增→结果分析

2、实验数据：

3、标准曲线：

R^2=1    y= -3.349x+32.87

关于Azure  Cielo™实时荧光定量PCR系统

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开始做qPCR实验喽，那么问题来了，我们需要做juedui定量还是相对定量呢？实验要如何设计？选择juedui定量要怎么做？相对定量方法又是怎么做呢？数据要如何评估呢？

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王培，毕业于福建农林大学，林木遗传育种专业硕士，具有五年丰富的qPCR实验经验，目前主要负责美国Azure qPCR产品和美国Quantabio qPCR试剂的支持及客户端应用工作。

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