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- fwjb4naio 2016-09-28 00:00:00
- 是做反转录还是real time PCR？ 反转录的话，可以用oligoT做反转录的引物，得到全部的cDNA，然后再利用特异性的引物去扩增出目的基因。或者直接用特异性的引物去反转录出来目的基因的cDNA，然后再进行PCR扩增。 引物设计的话，跟平常的引物设计应遵循的原则差不多。不过由于是扩增目的基因的coding sequence，所以引物设计的时候只能从coding sequence的两端设计，这样才能得到全长的目的基因。设计时，除了要与cDNA互补的一段外，还需要另外添加Kozac序列和酶切位点序列以及保护碱基，这样扩增出来的PCR产物就可以直接进行酶切连接，连入相应的载体上了。 real timePCR的话，同样根据需要扩增的片段设计引物就行了，没有位置的限制。
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导读
说起引物，大家都再熟悉不过了。引物，在核苷酸聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。无论是做普通PCR还是荧光定量PCR，设计合适的引物是非常关键的一步。
普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量，普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面，有什么相同点和不同点呢？今天小编就给大家汇总一下。
相同处：
▶ 序列的查找是一致的。
▶ 序列选取应在基因的保守区段。
▶ 选取合适的扩增片段大小。
▶ 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对。
▶ 避免引物自身形成环状发卡结构。
▶ Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%。
▶ 引物之间的Tm相差避免超过2℃。
▶ 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。
不同处：
荧光定量PCR 引物
▶ PCR产物长度：要求在300bp以内，一般选80-150bp之间。
▶ 引物特异性：对引物要求高，尽量减少引物二聚体的产生，熔解曲线要求单一产物。
▶ 扩增效率：荧光定量 PCR的目的是进行定量或者相对定量，扩增效率应在90%—110%之间。
▶ 多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物。
▶ 目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物。
普通PCR 引物
▶ 普通PCR的扩增长度，根据实验的要求不同，一般是从150bp到几千bp不等。
▶ 相对于荧光定量PCR，普通PCR对二级结构要求较低。
▶ 对扩增效率要求不高。
▶ 可以选用梯度PCR仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致。
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