3D成像：肿瘤及病理组织中的应用

常规的组织学检查通常使用冷冻或石蜡包埋的样本切片，微米级别厚度的组织切片允许对单个细胞进行标记及表征，但却无法探知生物样本的三维特性。切片分析只对病理样本的局部进行了探测研究，整个病理组织中，有相当大部分的信息仍未被探索。随着组织透明化技术的发展与光片显微镜的诞生，我们终于可以对完整样本进行完整的成像表征。最近发表在Nature Reviews Cancer的一篇综述中[1]总结了组织透明化、成像技术及3D成像的新应用等。

组织透明化方法在近十年内迅速发展，各种化合物的联合使用已被广泛用于减少光散射和光吸收，并增加光学显微镜在成像中的成像深度。虽然组织透明化最初由神经科学家用于描绘小鼠中shu和外周的神经系统，而近几年的研究表明，对于组织的三维成像也可助力发育生物学、免疫学、肿瘤学和肿瘤机理等多种学科。例如肿瘤研究中，三维荧光成像已被用于评估肿瘤迁移性、肿瘤组织结构、细胞异质性、表征肿瘤微环境和评估肿瘤模型的ZL反应等。

作者首先对各种透明化方法的特点进行了比较与介绍，肿瘤因其异质性及致密的结构首先需选择适当的透明化方式。接下来，作者介绍了3D成像在肿瘤研究中的应用：
1.成像并定量：2D成像无法避免因切片带来的数据缺失，3D成像则可以很直接的进行数据定量[2]；

2.肿瘤结构：3D成像有助于从细胞转化、细胞骨架等肿瘤模型中进行发生、发展分析[3]；

3.脉管系统：脉管系统与肿瘤进展及侵袭性相关，3D成像有助于评估抗血管生成的ZL反应[4]；

此外，对完整组织的3D成像也有助于对于肿瘤的转移评估、深入探索肿瘤微环境；肿瘤侵袭、传播与耐药性相关的病理研究；3D组织病理学研究等。

 
参考文献：[1] Almagro J, Messal HA, Zaw Thin M, van Rheenen J, Behrens A. Tissue clearing to examine tumour complexity in three dimensions. Nat Rev Cancer. 2021 Jul 30. doi: 10.1038/s41568-021-00382-w. Epub ahead of print. PMID: 34331034.[2] Wei M, Shi L, Shen Y, Zhao Z, Guzman A, Kaufman LJ, Wei L, Min W. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Apr 2;116(14):6608-6617. doi: 10.1073/pnas.1813044116. Epub 2019 Mar 14. PMID: 30872474; PMCID: PMC6452712.[3] Messal HA, Alt S, Ferreira RMM, Gribben C, Wang VM, Cotoi CG, Salbreux G, Behrens A. Tissue curvature and apicobasal mechanical tension imbalance instruct cancer morphogenesis. Nature. 2019 Feb;566(7742):126-130. doi: 10.1038/s41586-019-0891-2. Epub 2019 Jan 30. PMID: 30700911; PMCID: PMC7025886.[4] Dobosz M, Ntziachristos V, Scheuer W, Strobel S. Multispectral fluorescence ultramicroscopy: three-dimensional visualization and automatic quantification of tumor morphology, drug penetration, and antiangiogenic treatment response. Neoplasia. 2014 Jan;16(1):1-13. doi: 10.1593/neo.131848. PMID: 24563615; PMCID: PMC3924547.

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3D组织成像广泛应用于生命科学领域。研究人员利用它来揭示组织组成和完整性的详细信息，或从实验操作中得出结论，或比较健康与不健康的样本。本文介绍了MICA如何帮助研究人员进行3D组织成像。

3D组织成像

模式生物或患者的组织切片可用于分析从组织到细胞的各种形态，进而发现健康和非健康样本以及对照样品和实验样品之间的差异。例如，是否存在特定细胞或它们的形态（即形状、体积、长度、面积）都是有意义的参数。

荧光显微镜有助于识别特定标记的细胞或细胞成分。因此，要么用转荧光标记基因生物，要么用免疫荧光染色。此外，某些基因和转录也可以通过荧光原位杂交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 进行可视化。

3D组织成像的一个示例是，对脑部神经元进行成像，以确定它们的长度、体积或与其它细胞的连接。例如，可以对患有局部脑缺血的模式生物制作脑部切片，以了解形态差异和细胞数量。

挑战

首要的挑战之一是使用显微镜初步观察样本。需要将样本置于载物台上并不断调整三维位置以确保对样本进行正确成像。你从目镜或屏幕上看到的只是样本极小的一部分。因此，要将样本保持在正确的焦距内并找到正确位置，以便找到感兴趣的区域，是一个非常麻烦的过程。MICA的样本查找功能通过将样本聚焦并生成每个相关区域的低倍率预览图来自动化这个过程，这个功能可以用于整个成像过程的定位。

下一个挑战是设置成像参数，因此可以在看到感兴趣的信号下，避免样本遭受不必要的光漂白。这一步骤通常要同时选择激发和接受检测的技术参数，因为每一项参数都会对样本和获得的结果产生不同的影响。使用MICA，您只需轻轻点击一下“Live”，便可自动完成可视化荧光所需的所有参数设置。可随时通过点击“OneTouch”执行这一自动化设置来优化当前视图的参数。更改显微镜的特定技术参数前，实验人员通常需要了解更改参数将产生的影响，但在MICA中，设置是输出驱动型的，也就是说，可定义所需的输出，然后自动完成对应的调整。

一般而言，第一步是确定要成像的正确位置。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的概览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低倍或高倍的预览，轻松定位感兴趣的区域，并可以使用工具直接在图像上标记出感兴趣的样本区域。这样后续高分辨率图片就可以保存下来。

高放大倍数物镜通常需要使用浸没式介质，最常见的是水和油。水为水溶液中的成像样品匹配了最佳的光学指数，而油为包埋的成像样品匹配了最佳的光学指数。水浸物镜也可用于固定式样本，但会稍微影响成像质量。MICA可同时满足两种需求。水镜还具有全自动化操作的额外优势，水的浸入可以自动建立并维持。为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

相对厚度是组织切片成像的另一大挑战。厚切片会形成较多的散射光，干扰所需信号。THUNDER可减少背景模糊，为组织成像提供了一种宝贵的计算成像方法。 MICA集THUNDER于一体，可在合理的时间范围内确定感兴趣的区域，

除了类似于THUNDER的计算清除方法，共聚焦激光扫描显微术(CLSM)等光学部分也是3D组织玻片成像的一种方法。这种方法中，可获得性和可用性方面也是挑战。

除了技术设置比较复杂，共聚焦显微镜所需的培训时间一般也更长。MICA集共聚焦和宽场成像于一体，最大程度减少了成像参数设置，缩短了所需的培训时间，同时也降低了操作显微镜的技能要求。

另外，共聚焦和宽场成像模式的图像设置有相同的外观和使用感受，因此，用户无需学习两种系统的操作方法。而且，用户可随意在宽场和共聚焦两种模式间切换而无需在两种成像系统间转移样本。

科学实验的一个关键方面是，改变尽可能少的变量，以确定对样本和结果的任何影响。除了保证样本处理相同外，另一个方面是针对激发和接收检测成像参数相同。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像轻松恢复成像参数。

方法

三个厚度为250µm的小鼠脑部切片包含下述荧光标记物：

· 细胞核（DAPI，品红色）

· 神经元（细胞质GFP，青色）

· 星形胶质细胞（GFAP-DsRed，红色）

将切片固定于载玻片支架中（图1）并置于载物台上进行成像。

图2： MICA在实验开始时进行完整的玻片预览（宽场），便于更轻松地定位。

借助该信息的信息，可找到大图扫描拼接的感兴趣区域。可使用Magic Wand工具自动化检测感兴趣区域。

MICA可同时采集最多四个荧光团，因此相比基于滤光块的序列成像的显微系统，可有效节约用户的时间。在单次扫描拼接中，可找到感兴趣区域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍数观察更多的细节。

二维图像需要借助三维数据以获得更详细的信息。为此，z界面中定义了三维立体模式。

在CLSM下进行立体采集后（120µm厚），可在三维观察器中可视化数据，获得脑部样本的更多空间信息。

 图3：三维重构CLSM。

通过三维采集进一步研究组织切片。利用获得的三维信息，用户可以更好地了解样本的空间状况，例如了解细胞间的连接。

对于定量来说，可根据三维采集信息生成最大投影来测量样本树突棘的平均面积。pixel classifier识别棘突，分析工具则确定面积。得到的数值可绘制成图，以可视化数据和相关性。图4显示了树突棘面积的直方图。这些结果也可通过箱线图的形式显示，来比较不同的树突棘群落（图4）。

图4：分析。

MICA不仅采集图像，还可对它们进行分析。为此，可使用基于人工智能技术的pixel classifier来识别相关的图像细节。随后，识别出的对象可以被量化并显示在图形中。在本示例中，树突棘的平均面积在最大投影上测量。

结论

MICA是用于三维组织成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用户可以快速了解样本的整体质量，确定进一步的操作。随后，Navigator视图可对组织切片进行更深入的观察。Magic Wand等工具用于快速定义感兴趣的区域，加上4个通道的同时成像，可加快大图扫描拼接的速度。使用新的z界面使三维采集更加简化，pixel classifier能辅助后续分析。

简而言之，MICA集宽场成像和共聚焦成像于一个系统中。它可以帮助用户在一个系统中完成从图像预览到三维细节成像再到分析的整个工作流程。

全场景显微成像分析平台MICA集3D采集和AI定量于一体。

3D组织成像广泛应用于生命科学领域。研究人员利用它来揭示组织组成和完整性的详细信息，或从实验操作中得出结论，或比较健康与不健康的样本。本文介绍了MICA如何帮助研究人员进行3D组织成像。

3D组织成像

模式生物或患者的组织切片可用于分析从组织到细胞的各种形态，进而发现健康和非健康样本以及对照样品和实验样品之间的差异。例如，是否存在特定细胞或它们的形态（即形状、体积、长度、面积）都是有意义的参数。

荧光显微镜有助于识别特定标记的细胞或细胞组分。因此，要么用转荧光标记基因生物，要么用免疫荧光染色。此外，某些基因和转录也可以通过荧光原位杂交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 进行可视化。

3D组织成像的一个示例是，对脑部神经元进行成像，以确定它们的长度、体积或与其它细胞的连接。例如，可以对患有局部脑缺血的模式生物制作脑部切片，以了解形态差异和细胞数量。

挑 战

首要的挑战之一是使用显微镜初步观察样本。需要将样本置于载物台上并不断调整三维位置以确保对样本进行正确成像。你从目镜或屏幕上看到的只是样本极小的一部分。因此，要将样本保持在正确的焦距内并找到正确位置，以便找到感兴趣的区域，是一个非常麻烦的过程。MICA的样本查找功能通过将样本聚焦并生成每个相关区域的低倍率预览图来自动化这个过程，这个功能可以用于整个成像过程的定位。

下一个挑战是设置成像参数，因此可以在看到感兴趣的信号下，避免样本遭受不必要的光漂白。这一步骤通常要同时选择激发和接受检测的技术参数，因为每一项参数都会对样本和获得的结果产生不同的影响。使用MICA，您只需轻轻点击一下“Live”，便可自动完成可视化荧光所需的所有参数设置。可随时通过点击“OneTouch”执行这一自动化设置来优化当前视图的参数。更改显微镜的特定技术参数前，实验人员通常需要了解更改参数将产生的影响，但在MICA中，设置是输出驱动型的，也就是说，可定义所需的输出，然后自动完成对应的调整。

一般而言，第 一步是确定要成像的正确位置。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的概览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低倍或高倍的预览，轻松定位感兴趣的区域，并可以使用工具直接在图像上标记出感兴趣的样本区域。这样后续高分辨率图片就可以保存下来。

高放大倍数物镜通常需要使用浸没式介质，最 常见的是水和油。水为水溶液中的成像样品匹配了最 佳的光学指数，而油为包埋的成像样品匹配了最 佳的光学指数。水浸物镜也可用于固定式样本，但会稍微影响成像质量。MICA可同时满足两种需求。水镜还具有全自动化操作的额外优势，水的浸入可以自动建立并维持。为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

相对厚度是组织切片成像的另一大挑战。厚切片会形成较多的散射光，干扰所需信号。THUNDER可减少背景模糊，为组织成像提供了一种宝贵的计算成像方法。 MICA集THUNDER于一体，可在合理的时间范围内确定感兴趣的区域。

除了类似于THUNDER的计算清除方法，共聚焦激光扫描显微术(CLSM)等光学部分也是3D组织玻片成像的一种方法。这种方法中，可获得性和可用性方面也是挑战。

除了技术设置比较复杂，共聚焦显微镜所需的培训时间一般也更长。MICA集共聚焦和宽场成像于一体，最 大程度减少了成像参数设置，缩短了所需的培训时间，同时也降低了操作显微镜的技能要求。

另外，共聚焦和宽场成像模式的图像设置有相同的外观和使用感受，因此，用户无需学习两种系统的操作方法。而且，用户可随意在宽场和共聚焦两种模式间切换而无需在两种成像系统间转移样本。

科学实验的一个关键方面是，改变尽可能少的变量，以确定对样本和结果的任何影响。除了保证样本处理相同外，另一个方面是针对激发和接收检测成像参数相同。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像轻松恢复成像参数。

方法

三个厚度为250µm的小鼠脑部切片包含下述荧光标记物：

• 细胞核（DAPI，品红色）

• 神经元（细胞质GFP，青色）

• 星形胶质细胞（GFAP-DsRed，红色）

将切片固定于载玻片支架中（图1）并置于载物台上进行成像。

图1：用于玻片成像的MICA玻片夹，例如组织切片。

在样本定义中输入盖玻片类型和染料等基本信息。利用这一信息，Sample Finder可以识别盖玻片并自动生成低倍的预览。对整个盖玻片的预览可以用来识别三个组织切片，然后用Navigator工具进行标记。随后无需手动调整成像参数，便可以在20倍宽场模式下对标记区域生成扫描拼接图像。在这个放大倍数和分辨率下，就能在组织切片上识别出感兴趣的区域，然后用共聚焦显微镜成像。此时，MICA会在相关区域切换为共聚焦模式，记录高清晰图像，包括三维立体图像。定义三维立体图像时，可以手动或单击鼠标自动设置限制。z Range Finder工具自动确定3D图像扫描开始和结束部分。

成像后，可借助MICA Learn & Results工具测量树突棘。为此，使用pixel classifier在叠层投影下识别棘突。pixel classifier简单易用且功能强大，用户只需使用类似于绘画工具的绘图工具标记对象的示例，在这种情况下为棘突。通过训练模型，更好地再现输入，然后提供图像中其他对象的预览。经过训练后，就可使用模型分析图像。 

结果

找到载玻片预览上单个脑部切片，然后使用Magic Wand工具进行标记以进行扫描拼接。Magic Wand自动识别组织切片的边界并相应地定义所需的拼接。

图2：MICA在实验开始时进行完整的玻片预览（宽场），便于更轻松地定位。借助该信息的信息，可找到大图扫描拼接的感兴趣区域。可使用Magic Wand工具自动化检测感兴趣区域。

MICA可同时采集最 多四个荧光团，因此相比基于滤光块的序列成像的显微系统，可有效节约用户的时间。在单次扫描拼接中，可找到感兴趣区域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍数观察更多的细节。

二维图像需要借助三维数据以获得更详细的信息。为此，z界面中定义了三维立体模式。

在CLSM下进行立体采集后（120µm厚），可在三维观察器中可视化数据，获得脑部样本的更多空间信息。

图3：三维重构CLSM。通过三维采集进一步研究组织切片。利用获得的三维信息，用户可以更好地了解样本的空间状况，例如了解细胞间的连接。

对于定量来说，可根据三维采集信息生成最 大投影来测量样本树突棘的平均面积。pixel classifier识别棘突，分析工具则确定面积。得到的数值可绘制成图，以可视化数据和相关性。图4显示了树突棘面积的直方图。这些结果也可通过箱线图的形式显示，来比较不同的树突棘群落（图4）。

图4：分析。MICA不仅采集图像，还可对它们进行分析。

为此，可使用基于人工智能技术的pixel classifier来识别相关的图像细节。随后，识别出的对象可以被量化并显示在图形中。在本示例中，树突棘的平均面积在最 大投影上测量。

结论

MICA是用于三维组织成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用户可以快速了解样本的整体质量，确定进一步的操作。随后，Navigator视图可对组织切片进行更深入的观察。Magic Wand等工具用于快速定义感兴趣的区域，加上4个通道的同时成像，可加快大图扫描拼接的速度。使用新的z界面使三维采集更加简化，pixel classifier能辅助后续分析。

简而言之，MICA集宽场成像和共聚焦成像于一个系统中。它可以帮助用户在一个系统中完成从图像预览到三维细节成像再到分析的整个工作流程。

参考资料：

Efficient Long-term Time-lapse Microscopy, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

什么是造影剂

      核磁共振成像（MRI)目前普遍应用于医学检测成像中，具有无辐射损伤的安全性，可任意方位断层扫描等技术灵活性，加以涵盖质子密度、弛豫、加权成像以及多参数特征的优势，已成为当代临床诊断中Z有力的检测手段之一，然而临床发现某些不同组织或肿瘤组织的弛豫时间相互重叠,导致诊断困难。因此人们开始研究造影剂，增强信号对比度、提高图像分辨率。其作用主要是通过注射造影剂来改变组织局部弛豫特性，提高成像对比度，从而提高诊断的准确性。

      造影剂是一类化学合成的其密度高于活体组织的物质，造影剂本身不产生信号，通过改变体内局部组织中水质子的弛豫效率，与周围组织形 成对比，从而达到造影目的。

造影剂的原理

      带有磁性的物质如Fe、Mn、Gd等，具有多个不成对的电子，当这些物质接近共振中的氢原子时，能有效地改变质子所处的磁场，造成T1和T2弛豫时间明显缩短。造影剂能改变体内局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常与患病部位的成像对比度和分辨率，为病变定位和诊断提供更多的信息（图1和图2所示）。

      MRI造影剂又为顺磁性或超顺磁性物质，能同氢核发生磁性的相互作用，他们进入动物体内，将引起纵向弛豫速率（1/T1)和横向弛豫速率（1/T2)的改变，在顺磁物质的作用下，其抗磁和顺磁贡献具有加和性，即：

(1/Ti)观察=(1/Ti)抗磁+(1/Ti)顺磁 , (其中i=1,2)

在不存在溶质之间相互作用的情况下，溶剂的弛豫速率与所加的顺磁物质的浓度（mol/L)成线性关系，即：

(1/Ti)观测=(1/Ti)抗磁+求和ri[C] , (其中i=1,2)

其中ri为顺磁物质的弛豫效率（Relaxivity，单位mmol/L·s），求和是针对溶液中造影剂的种类而言，T1类型造影剂，如Gd类配合物，成像时相关部位变亮，又称为阳性造影剂；T2类型造影剂，如基于Fe3O4离子的超顺磁性造影剂，成像时相关部位变暗，又称为阴性造影剂。

造影剂的应用：

弛豫效率是MRI造影剂关键指标之一。弛豫效率高的样品，可以使用Z少的量达到Z好的效果；在造影剂研究领域，纽迈专门开发了小型的核磁共振成像分析仪，可测试方便的测试造影剂T1、T2弛豫时间，并可对试管样品进行成像，提供定量和定性评价数据，为造影剂产品的研发与改进提供快速可靠的检测手段。

造影剂在体内的作用评价：

造影剂在肾脏中的代谢过程监测，该造影剂在小鼠体内肾脏部位代谢时间超过250min,且作用顶峰时间约在注入后130min。 

在生物医药领域，低场核磁共振可为您提供以下科研方案

1)造影剂研究：弛豫率 效能评价 体内代谢评价；

2)体表肿瘤研究：造影材料作用 药物靶向 肿瘤药效评估;

3)原位肿瘤研究：位置排查 转移判断 尺寸测试；

4)清醒动物体成分分析：瘦肉 脂肪 自由水含量 脂肪分布；

（来源：苏州纽迈分析仪器股份有限公司）

本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）实现尤文（尤因）肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节观察，从而协助本研究的进行。活细胞成像等技术在了解肿瘤进展和转移研究中至关重要。真核细胞中的有丝分裂纺锤体由中空的微管组成。它在有丝分裂期间的细胞内重复染色体分离和分裂细胞细胞骨架结构的构建过程中发挥着重要的作用。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认。

简介

使用荧光显微镜可以研究肿瘤形成和进展过程中组织及细胞内部发生的变化。像活细胞成像这样的技术对更加深入地了解肿瘤进展和转移是至关重要的。

在真核细胞中，由中空微管组成的有丝分裂纺锤体，有助于构建复制细胞的细胞骨架结构，并在有丝分裂过程中将复制的染色体从原始细胞中分离出来。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认[1]。

肉瘤是肌肉或骨骼等结缔组织中形成的一类肿瘤。尤文肉瘤和横纹肌肉瘤，分别生长于骨骼和肌肉中，是一种倾向于发生在骨骼生长活跃区域附近的儿科肿瘤。除了手术和化疗之外，电离辐射也被用于治疗这类肿瘤，但这可能会导致生长中的骨骼受到永jiu性损伤，包括不对称生长停滞、胫骨畸形及骨折概率增加等。骨骼损伤的严重度在很大程度上与骨骼接受的辐射剂量成正比。因此，我们有理由认为，选择性放射致敏肿瘤组织的策略可降低实现局部控制所需的辐射剂量，并能最大限度降低对邻近健康组织造成的间接损伤。

运用体外研究和小鼠异种移植模型系统，对使用mRNA合成抑zhi剂光神霉素A预处理，可以通过改变辐射损伤的转录反应实现选择性放射致敏EWS：Fli1+肿瘤细胞的假设进行了验证[2]。结果表明，光神霉素A可以通过抑zhi参与DNA损伤修复相关基因的转录，使EWS：Fli1+细胞在体内外显著放射增敏，导致肿瘤细胞程序性死亡[2]。

使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节，协助癌症研究人员获得更有用的见解。

挑战

在有丝分裂纺锤体成像中，可对其实现快速成像，并获得清晰的高对比度3D成像，以清晰展示重要细节的解决方案最为实用。传统的宽场显微成像速度快，检测灵敏度高，但不幸的是对于厚样本的成像通常会出现失焦不清晰或模糊的情况，这会降低对比度[3]。要阐明有丝分裂的不稳定性在癌症等复杂疾病中的作用，这需要在同一样本中进行多个关联生物学标记。

方法

该研究中使用了尤文肉瘤细胞（SK-ES-1）。对这些细胞进行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀释/ Dylight 488偶联驴抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀释/Dylight 550偶联驴抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342蓝）进行染色。染色后，使用介质ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）进行盖玻片封片，并通过使用63×/1.4 NA（数值孔径）的油镜进行THUNDER Imager Tissue成像。图像采集使用大体积成像解析（LVCC）[3]模式，并生成最大化投影图像数据。

结果

在有丝分裂过程中，α-微管蛋白（绿色）形成有丝分裂纺锤体，染色单体（蓝色）会附着在有丝分裂纺锤体上，而γ-微管蛋白（红色）集中定位在分裂细胞中的纺锤极上。通过THUNDER技术可观察到肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。清晰的图像可以展示清晰的结构，以便进行分割和进一步的分析。

图1：尤文肉瘤细胞SK-ES-1 α-微管蛋白（绿色）、γ-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）染色后的最大化投影：原始图像数据（左）和THUNDER LVCC模式成像数据（右）。

 结 论 

THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]进行尤文肉瘤细胞中的有丝分裂纺锤体成像时可显著增强对比度。与传统的宽场成像相比，其可展示细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。

References：

1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Muñoz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.

2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.

3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

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微透镜

(a) 为微透镜的大视野3D图像，通过hitachi MAP 3D 将多张3D 图像拼接而成。

(b) 为（a）中红框部分的形貌像。通过颜色标尺很容易确定高度信息。

(c)(d)是提取的图.1(b)中划线区域的结果，可以获得每个透镜（箭头 0-1, 2-3）的水平距离、垂直高度以及顶部和底部的角度。

所以，使用Hitachi Map 3D可以获得大视野3D图像和截面轮廓信息。

(a)拼接后的3D图像(x2k), (b)红框内的形貌图

（c）(b)中划线区域的截面

观察机型：FlexSEM1000 

观察条件：5 kV, 2000倍, 30Pa 软件：Hitachi Map 3D

Material

【大视野3D观察】

FlexSEM1000