仪器网（yiqi.com）欢迎您！

常规的组织学检查通常使用冷冻或石蜡包埋的样本切片，微米级别厚度的组织切片允许对单个细胞进行标记及表征，但却无法探知生物样本的三维特性。切片分析只对病理样本的局部进行了探测研究，整个病理组织中，有相当大部分的信息仍未被探索。随着组织透明化技术的发展与光片显微镜的诞生，我们终于可以对完整样本进行完整的成像表征。最近发表在Nature Reviews Cancer的一篇综述中[1]总结了组织透明化、成像技术及3D成像的新应用等。

组织透明化方法在近十年内迅速发展，各种化合物的联合使用已被广泛用于减少光散射和光吸收，并增加光学显微镜在成像中的成像深度。虽然组织透明化最初由神经科学家用于描绘小鼠中shu和外周的神经系统，而近几年的研究表明，对于组织的三维成像也可助力发育生物学、免疫学、肿瘤学和肿瘤机理等多种学科。例如肿瘤研究中，三维荧光成像已被用于评估肿瘤迁移性、肿瘤组织结构、细胞异质性、表征肿瘤微环境和评估肿瘤模型的ZL反应等。

作者首先对各种透明化方法的特点进行了比较与介绍，肿瘤因其异质性及致密的结构首先需选择适当的透明化方式。接下来，作者介绍了3D成像在肿瘤研究中的应用：
1.成像并定量：2D成像无法避免因切片带来的数据缺失，3D成像则可以很直接的进行数据定量[2]；

2.肿瘤结构：3D成像有助于从细胞转化、细胞骨架等肿瘤模型中进行发生、发展分析[3]；

3.脉管系统：脉管系统与肿瘤进展及侵袭性相关，3D成像有助于评估抗血管生成的ZL反应[4]；

此外，对完整组织的3D成像也有助于对于肿瘤的转移评估、深入探索肿瘤微环境；肿瘤侵袭、传播与耐药性相关的病理研究；3D组织病理学研究等。

 
参考文献：[1] Almagro J, Messal HA, Zaw Thin M, van Rheenen J, Behrens A. Tissue clearing to examine tumour complexity in three dimensions. Nat Rev Cancer. 2021 Jul 30. doi: 10.1038/s41568-021-00382-w. Epub ahead of print. PMID: 34331034.[2] Wei M, Shi L, Shen Y, Zhao Z, Guzman A, Kaufman LJ, Wei L, Min W. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Apr 2;116(14):6608-6617. doi: 10.1073/pnas.1813044116. Epub 2019 Mar 14. PMID: 30872474; PMCID: PMC6452712.[3] Messal HA, Alt S, Ferreira RMM, Gribben C, Wang VM, Cotoi CG, Salbreux G, Behrens A. Tissue curvature and apicobasal mechanical tension imbalance instruct cancer morphogenesis. Nature. 2019 Feb;566(7742):126-130. doi: 10.1038/s41586-019-0891-2. Epub 2019 Jan 30. PMID: 30700911; PMCID: PMC7025886.[4] Dobosz M, Ntziachristos V, Scheuer W, Strobel S. Multispectral fluorescence ultramicroscopy: three-dimensional visualization and automatic quantification of tumor morphology, drug penetration, and antiangiogenic treatment response. Neoplasia. 2014 Jan;16(1):1-13. doi: 10.1593/neo.131848. PMID: 24563615; PMCID: PMC3924547.

锘海一站式科研服务，让科研变得更简单！

锘海生命科学为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

了解更多相关信息

请联系 021-37827858、13818273779（微信同号）

用SPAD512S在3D成像中的应用

在从空间成像到生物医学显微镜、安全、工业检查和文化遗产等众多领域，对快速、高分辨率和低噪声3D成像的要求非常高。在这种情况下，传统的全光成像代表了3D成像领域最有前景的技术之一，因为其超高的时间分辨率：

3D成像是在30M像素分辨率下每秒7帧的单次拍摄中实现的，对于1M像素分辨率为每秒180帧；无多个传感器，近场需要耗时的扫描或干涉技术。然而常规全光成像导致分辨率损失，这通常是不可接受的。我们打破这种限制的策略包括将一个全新的和基础性的采用上一代硬件和软件解决方案。基本思想是通过使用新型传感器来利用存储在光的相关性中的信息实现一项非常雄心勃勃的任务的测量协议：高速（10–100 fps）量子全光成像（QPI）具有超低噪声和前所未有的性能分辨率和景深的组合。所开发的成像技术旨在：在成为第一个实际可用和适当的“量子”成像技术超出了经典成像模式的固有限制。除了基础感兴趣的是，该技术的量子特性允许在3D上提取信息来自极低光子通量下的光相关性的图像，从而减少场景暴露于光照。对QPI的兴趣是由潜在的相对于其他已建立的3D成像技术的优点。实际上，其他与QPI不同，方法需要精细的干涉测量，如数字测量全息显微镜或相位恢复算法，如傅里叶全息图，或快速脉冲照明，如飞行时间（TOF）成像。此外，QPI提供了无扫描显微镜模式的基础，克服了共聚焦方法。

量子全光相机有望提供全光成像的优势，主要是超快和免扫描的 3D 成像和重聚焦能 力，其性能是经典相机无法企及的。全光成像设备能够在单次拍摄中获取多视角 图像.它们的工作原理是基于对给定场景中光的空间分布和传播方向的同时测量。获取 的方向信息转化为快速 3D 成像所需的重聚焦能力、可增加的景深(DOF)和多视角 2D 图像的 并行获取。 在全光照相机中，方向检测是通过在标准数码相机的主镜头和传感器之间插 入微透镜阵列来实现的。传感器获取复合信息，该复合信息允许识别检测到的光来自 的物点和透镜点。然而，由于结构(使用微透镜阵列)和基本(高斯极限)原因，图像分辨率与获 得的方向信息成反比地降低；因此，在基于简单强度测量的设备中，在衍射极限下的全光成像 被认为是无法实现的。

图(a)传统全光成像(PI)设备的方案:物体的图像聚焦在微透镜阵列上，而每个微透镜将主透镜 的图像聚焦在后面的像素上。这种配置需要与方向分辨率的增益成比例的空间分辨率的损失；(b)显 示了相关全光成像(CPI)设置的方案，其中方向信息是通过将物体聚焦的传感器检索到的信号与收集 光源图像的传感器相关联而获得的。

为了实现全光成像，我们正在寻求一个超高性能的探测器，一个相关部分是通过用基于尖端技术的传感器(如单光子雪崩 二极管(SPAD)阵列)取代商用高分辨率传感器(如科学 cmos 和 emccd 相机)来确定的。SPAD 基本上是一个光电二极管，其反向偏置电压高于其击穿电压，因此撞击其光敏区域的单个 光子可以产生电子-空穴对，从而触发次级载流子的雪崩，并在非常短的时间尺度(皮秒) 内产生大电流。这种操作方式被称为盖革模式。SPAD 输出电压由电子电路感测并直 接转换成数字信号，进一步处理以存储光子到达和/或光子到达时间的二进制信息。从本 质上来说，SPAD 可以被看作是一个具有精密时间精度的光子-数字转换装置。SPADs 也可以 选通，以便只在短至几纳秒的时间窗口内敏感。如今，单个 SPAD 可以用作大 型阵列的构建模块，每个像素电路都包含 SPAD 和即时光子处理逻辑和互连。有几种 CMOS 工艺可供选择，可以定制关键 SPAD 性能指标和整体传感器或成像器架构.灵敏度和 填充因子有一段时间落后于科学 CMOS 或 EMccd，但近年来已大幅赶上。 根据 QPI 的要求，我们选择使用由 EPFL AQUA laboratory group 开发的 SwisSPAD2 阵 列，其特点是 512×512 像素分辨率，这是迄今为止最广泛、SPAD 阵列 之一。传感器内部由 256×512 像素的两半组成，以减少信号线上的负载和偏斜，实 现更快的操作。这是一个纯粹的二进制门控成像器，即每个像素为每帧记录 0(无光子)或 1(一个或多个光子)，读出噪声基本为零。传感器由 FPGA 控制，FPGA 产生门控电路和读出 序列的控制信号，并收集像素检测结果。在 FPGA 中，在发送到计算机/GPU 进行分析和存 储之前，可以进一步处理得到的一位图像，例如，累积成多位图像。对于准直光，通过微 透镜阵列，最大帧速率为 97.7 kfps，10.5%的自然填充因子可以提高 4-5 倍 (优化后的 模拟预计会有更高的值)；在 520 纳米(700 纳米)和 6.5 伏过量偏压下，光子探测概率为 50% (25%)。该器件还具有低噪声(室温下每像素平均暗计数率通常低于 100 cps，中值约 低 10 倍)和纳秒门控电路。

SwissSPAD2 门窗口轮廓。图中标注了转换时间和栅极宽度。栅极宽度可由用户编程，内部激 光触发模式下的最小栅极宽度为 10.8 ns。

SwissSPAD2 显微照片(左)和像素示意图(右)。像素由 11 个 NMOS 晶体管组成，7 个具有厚氧化 物，4 个具有薄氧化物栅极。像素在其存储电容器中存储二进制光子计数。像素内门定义了相对于 20 MHz 外部触发信号的时间窗口，其中像素对光子敏感。

全全光相机是一种全新的 3D 成像设备，利用 动量-位置纠缠和光子数相关性来提供全光设备典型的重新聚焦和超快速、免扫描的 3D 成像能力，以及标 准全光相机无法实现的显著增强的性能:衍射极限分辨率、大焦深和超低噪声；然而，为了使所 提出的器件的量子优势有效并吸引最终用户，需要解决两个主要挑战。首先，由于相关测量需要大量的帧 来提供可接受的信噪比，如果用商业上可获得的高分辨率相机来实现，量子全光成像(QPI)将需要几十秒 到几分钟的采集时间。第二，为了检索 3D 图像或重新聚焦 2D 图像，对这大量数据的加工需要高性能和耗 时的计算。为了应对这些挑战，我们正在开发高分辨率单光子雪崩光电二极管(SPAD)阵列和超快速电子设 备的高性能低级编程，结合压缩传感和量子层析成像算法，旨在将采集和加工时间减少两个数量级。还将 讨论开发 QPI 设备的途径。

下面我将介绍下我们昊量光电所有一款SPAD512S相机，对全光成像具有很大的帮助。

我们的相机相对其他产品具有如下优点：

1. 相机具有很高的填充因子，并且还带有微透镜。

2. 暗噪声非常小

3. 成像速度快

4. 面阵像素大，分辨率高

相关文献：

https://doi.org/10.3390/app11146414

对于定制设备像素，我们完全符合您的需求 - 我们喜欢挑战！为此，我们与业内一些供应商密切合作欢迎大家来电咨询。

如果您对SPAD512S单光子相机有兴趣，请访问上海昊量光电的官方网页查看更多SPAD512S单光子相机系列产品：

https://www.auniontech.com/details-1782.html

更多详情请联系昊量光电/欢迎直接联系昊量光电

关于昊量光电：

上海昊量光电设备有限公司是光电产品专业代理商，产品包括各类激光器、光电调制器、光学测量设备、光学元件等，涉及应用涵盖了材料加工、光通讯、生物医疗、科学研究、国防、量子光学、生物显微、物联传感、激光制造等；可为客户提供完整的设备安装，培训，硬件开发，软件开发，系统集成等服务。

您可以通过我们昊量光电的官方网站www.auniontech.com了解更多的产品信息，或直接来电咨询4006-888-532。

全场景显微成像分析平台MICA集3D采集和AI定量于一体。

3D组织成像广泛应用于生命科学领域。研究人员利用它来揭示组织组成和完整性的详细信息，或从实验操作中得出结论，或比较健康与不健康的样本。本文介绍了MICA如何帮助研究人员进行3D组织成像。

3D组织成像

模式生物或患者的组织切片可用于分析从组织到细胞的各种形态，进而发现健康和非健康样本以及对照样品和实验样品之间的差异。例如，是否存在特定细胞或它们的形态（即形状、体积、长度、面积）都是有意义的参数。

荧光显微镜有助于识别特定标记的细胞或细胞组分。因此，要么用转荧光标记基因生物，要么用免疫荧光染色。此外，某些基因和转录也可以通过荧光原位杂交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 进行可视化。

3D组织成像的一个示例是，对脑部神经元进行成像，以确定它们的长度、体积或与其它细胞的连接。例如，可以对患有局部脑缺血的模式生物制作脑部切片，以了解形态差异和细胞数量。

挑 战

首要的挑战之一是使用显微镜初步观察样本。需要将样本置于载物台上并不断调整三维位置以确保对样本进行正确成像。你从目镜或屏幕上看到的只是样本极小的一部分。因此，要将样本保持在正确的焦距内并找到正确位置，以便找到感兴趣的区域，是一个非常麻烦的过程。MICA的样本查找功能通过将样本聚焦并生成每个相关区域的低倍率预览图来自动化这个过程，这个功能可以用于整个成像过程的定位。

下一个挑战是设置成像参数，因此可以在看到感兴趣的信号下，避免样本遭受不必要的光漂白。这一步骤通常要同时选择激发和接受检测的技术参数，因为每一项参数都会对样本和获得的结果产生不同的影响。使用MICA，您只需轻轻点击一下“Live”，便可自动完成可视化荧光所需的所有参数设置。可随时通过点击“OneTouch”执行这一自动化设置来优化当前视图的参数。更改显微镜的特定技术参数前，实验人员通常需要了解更改参数将产生的影响，但在MICA中，设置是输出驱动型的，也就是说，可定义所需的输出，然后自动完成对应的调整。

一般而言，第 一步是确定要成像的正确位置。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的概览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低倍或高倍的预览，轻松定位感兴趣的区域，并可以使用工具直接在图像上标记出感兴趣的样本区域。这样后续高分辨率图片就可以保存下来。

高放大倍数物镜通常需要使用浸没式介质，最 常见的是水和油。水为水溶液中的成像样品匹配了最 佳的光学指数，而油为包埋的成像样品匹配了最 佳的光学指数。水浸物镜也可用于固定式样本，但会稍微影响成像质量。MICA可同时满足两种需求。水镜还具有全自动化操作的额外优势，水的浸入可以自动建立并维持。为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

相对厚度是组织切片成像的另一大挑战。厚切片会形成较多的散射光，干扰所需信号。THUNDER可减少背景模糊，为组织成像提供了一种宝贵的计算成像方法。 MICA集THUNDER于一体，可在合理的时间范围内确定感兴趣的区域。

除了类似于THUNDER的计算清除方法，共聚焦激光扫描显微术(CLSM)等光学部分也是3D组织玻片成像的一种方法。这种方法中，可获得性和可用性方面也是挑战。

除了技术设置比较复杂，共聚焦显微镜所需的培训时间一般也更长。MICA集共聚焦和宽场成像于一体，最 大程度减少了成像参数设置，缩短了所需的培训时间，同时也降低了操作显微镜的技能要求。

另外，共聚焦和宽场成像模式的图像设置有相同的外观和使用感受，因此，用户无需学习两种系统的操作方法。而且，用户可随意在宽场和共聚焦两种模式间切换而无需在两种成像系统间转移样本。

科学实验的一个关键方面是，改变尽可能少的变量，以确定对样本和结果的任何影响。除了保证样本处理相同外，另一个方面是针对激发和接收检测成像参数相同。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像轻松恢复成像参数。

方法

三个厚度为250µm的小鼠脑部切片包含下述荧光标记物：

• 细胞核（DAPI，品红色）

• 神经元（细胞质GFP，青色）

• 星形胶质细胞（GFAP-DsRed，红色）

将切片固定于载玻片支架中（图1）并置于载物台上进行成像。

图1：用于玻片成像的MICA玻片夹，例如组织切片。

在样本定义中输入盖玻片类型和染料等基本信息。利用这一信息，Sample Finder可以识别盖玻片并自动生成低倍的预览。对整个盖玻片的预览可以用来识别三个组织切片，然后用Navigator工具进行标记。随后无需手动调整成像参数，便可以在20倍宽场模式下对标记区域生成扫描拼接图像。在这个放大倍数和分辨率下，就能在组织切片上识别出感兴趣的区域，然后用共聚焦显微镜成像。此时，MICA会在相关区域切换为共聚焦模式，记录高清晰图像，包括三维立体图像。定义三维立体图像时，可以手动或单击鼠标自动设置限制。z Range Finder工具自动确定3D图像扫描开始和结束部分。

成像后，可借助MICA Learn & Results工具测量树突棘。为此，使用pixel classifier在叠层投影下识别棘突。pixel classifier简单易用且功能强大，用户只需使用类似于绘画工具的绘图工具标记对象的示例，在这种情况下为棘突。通过训练模型，更好地再现输入，然后提供图像中其他对象的预览。经过训练后，就可使用模型分析图像。 

结果

找到载玻片预览上单个脑部切片，然后使用Magic Wand工具进行标记以进行扫描拼接。Magic Wand自动识别组织切片的边界并相应地定义所需的拼接。

图2：MICA在实验开始时进行完整的玻片预览（宽场），便于更轻松地定位。借助该信息的信息，可找到大图扫描拼接的感兴趣区域。可使用Magic Wand工具自动化检测感兴趣区域。

MICA可同时采集最 多四个荧光团，因此相比基于滤光块的序列成像的显微系统，可有效节约用户的时间。在单次扫描拼接中，可找到感兴趣区域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍数观察更多的细节。

二维图像需要借助三维数据以获得更详细的信息。为此，z界面中定义了三维立体模式。

在CLSM下进行立体采集后（120µm厚），可在三维观察器中可视化数据，获得脑部样本的更多空间信息。

图3：三维重构CLSM。通过三维采集进一步研究组织切片。利用获得的三维信息，用户可以更好地了解样本的空间状况，例如了解细胞间的连接。

对于定量来说，可根据三维采集信息生成最 大投影来测量样本树突棘的平均面积。pixel classifier识别棘突，分析工具则确定面积。得到的数值可绘制成图，以可视化数据和相关性。图4显示了树突棘面积的直方图。这些结果也可通过箱线图的形式显示，来比较不同的树突棘群落（图4）。

图4：分析。MICA不仅采集图像，还可对它们进行分析。

为此，可使用基于人工智能技术的pixel classifier来识别相关的图像细节。随后，识别出的对象可以被量化并显示在图形中。在本示例中，树突棘的平均面积在最 大投影上测量。

结论

MICA是用于三维组织成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用户可以快速了解样本的整体质量，确定进一步的操作。随后，Navigator视图可对组织切片进行更深入的观察。Magic Wand等工具用于快速定义感兴趣的区域，加上4个通道的同时成像，可加快大图扫描拼接的速度。使用新的z界面使三维采集更加简化，pixel classifier能辅助后续分析。

简而言之，MICA集宽场成像和共聚焦成像于一个系统中。它可以帮助用户在一个系统中完成从图像预览到三维细节成像再到分析的整个工作流程。

参考资料：

Efficient Long-term Time-lapse Microscopy, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

全场景显微成像分析平台MICA集3D采集和AI定量于一体。

3D组织成像广泛应用于生命科学领域。研究人员利用它来揭示组织组成和完整性的详细信息，或从实验操作中得出结论，或比较健康与不健康的样本。本文介绍了MICA如何帮助研究人员进行3D组织成像。

3D组织成像

模式生物或患者的组织切片可用于分析从组织到细胞的各种形态，进而发现健康和非健康样本以及对照样品和实验样品之间的差异。例如，是否存在特定细胞或它们的形态（即形状、体积、长度、面积）都是有意义的参数。

荧光显微镜有助于识别特定标记的细胞或细胞成分。因此，要么用转荧光标记基因生物，要么用免疫荧光染色。此外，某些基因和转录也可以通过荧光原位杂交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 进行可视化。

3D组织成像的一个示例是，对脑部神经元进行成像，以确定它们的长度、体积或与其它细胞的连接。例如，可以对患有局部脑缺血的模式生物制作脑部切片，以了解形态差异和细胞数量。

挑战

首要的挑战之一是使用显微镜初步观察样本。需要将样本置于载物台上并不断调整三维位置以确保对样本进行正确成像。你从目镜或屏幕上看到的只是样本极小的一部分。因此，要将样本保持在正确的焦距内并找到正确位置，以便找到感兴趣的区域，是一个非常麻烦的过程。MICA的样本查找功能通过将样本聚焦并生成每个相关区域的低倍率预览图来自动化这个过程，这个功能可以用于整个成像过程的定位。

下一个挑战是设置成像参数，因此可以在看到感兴趣的信号下，避免样本遭受不必要的光漂白。这一步骤通常要同时选择激发和接受检测的技术参数，因为每一项参数都会对样本和获得的结果产生不同的影响。使用MICA，您只需轻轻点击一下“Live”，便可自动完成可视化荧光所需的所有参数设置。可随时通过点击“OneTouch”执行这一自动化设置来优化当前视图的参数。更改显微镜的特定技术参数前，实验人员通常需要了解更改参数将产生的影响，但在MICA中，设置是输出驱动型的，也就是说，可定义所需的输出，然后自动完成对应的调整。

一般而言，第一步是确定要成像的正确位置。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。数字显微镜可以生成样本的概览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低倍或高倍的预览，轻松定位感兴趣的区域，并可以使用工具直接在图像上标记出感兴趣的样本区域。这样后续高分辨率图片就可以保存下来。

高放大倍数物镜通常需要使用浸没式介质，最常见的是水和油。水为水溶液中的成像样品匹配了最佳的光学指数，而油为包埋的成像样品匹配了最佳的光学指数。水浸物镜也可用于固定式样本，但会稍微影响成像质量。MICA可同时满足两种需求。水镜还具有全自动化操作的额外优势，水的浸入可以自动建立并维持。为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

相对厚度是组织切片成像的另一大挑战。厚切片会形成较多的散射光，干扰所需信号。THUNDER可减少背景模糊，为组织成像提供了一种宝贵的计算成像方法。 MICA集THUNDER于一体，可在合理的时间范围内确定感兴趣的区域，

除了类似于THUNDER的计算清除方法，共聚焦激光扫描显微术(CLSM)等光学部分也是3D组织玻片成像的一种方法。这种方法中，可获得性和可用性方面也是挑战。

除了技术设置比较复杂，共聚焦显微镜所需的培训时间一般也更长。MICA集共聚焦和宽场成像于一体，最大程度减少了成像参数设置，缩短了所需的培训时间，同时也降低了操作显微镜的技能要求。

另外，共聚焦和宽场成像模式的图像设置有相同的外观和使用感受，因此，用户无需学习两种系统的操作方法。而且，用户可随意在宽场和共聚焦两种模式间切换而无需在两种成像系统间转移样本。

科学实验的一个关键方面是，改变尽可能少的变量，以确定对样本和结果的任何影响。除了保证样本处理相同外，另一个方面是针对激发和接收检测成像参数相同。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像轻松恢复成像参数。

方法

三个厚度为250µm的小鼠脑部切片包含下述荧光标记物：

· 细胞核（DAPI，品红色）

· 神经元（细胞质GFP，青色）

· 星形胶质细胞（GFAP-DsRed，红色）

将切片固定于载玻片支架中（图1）并置于载物台上进行成像。

图2： MICA在实验开始时进行完整的玻片预览（宽场），便于更轻松地定位。

借助该信息的信息，可找到大图扫描拼接的感兴趣区域。可使用Magic Wand工具自动化检测感兴趣区域。

MICA可同时采集最多四个荧光团，因此相比基于滤光块的序列成像的显微系统，可有效节约用户的时间。在单次扫描拼接中，可找到感兴趣区域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍数观察更多的细节。

二维图像需要借助三维数据以获得更详细的信息。为此，z界面中定义了三维立体模式。

在CLSM下进行立体采集后（120µm厚），可在三维观察器中可视化数据，获得脑部样本的更多空间信息。

 图3：三维重构CLSM。

通过三维采集进一步研究组织切片。利用获得的三维信息，用户可以更好地了解样本的空间状况，例如了解细胞间的连接。

对于定量来说，可根据三维采集信息生成最大投影来测量样本树突棘的平均面积。pixel classifier识别棘突，分析工具则确定面积。得到的数值可绘制成图，以可视化数据和相关性。图4显示了树突棘面积的直方图。这些结果也可通过箱线图的形式显示，来比较不同的树突棘群落（图4）。

图4：分析。

MICA不仅采集图像，还可对它们进行分析。为此，可使用基于人工智能技术的pixel classifier来识别相关的图像细节。随后，识别出的对象可以被量化并显示在图形中。在本示例中，树突棘的平均面积在最大投影上测量。

结论

MICA是用于三维组织成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用户可以快速了解样本的整体质量，确定进一步的操作。随后，Navigator视图可对组织切片进行更深入的观察。Magic Wand等工具用于快速定义感兴趣的区域，加上4个通道的同时成像，可加快大图扫描拼接的速度。使用新的z界面使三维采集更加简化，pixel classifier能辅助后续分析。

简而言之，MICA集宽场成像和共聚焦成像于一个系统中。它可以帮助用户在一个系统中完成从图像预览到三维细节成像再到分析的整个工作流程。

 概述

基于 T 细胞的疗法正在迅速发展成为许多癌症的有效一线ZL选择。近年来， FDA 已经批准了几种针对免疫检查点的ZL性抗体和小分子用于临床，以补充和提高T 细胞的靶向性和有效性。这些免疫检查点YZ剂的临床前筛选需要强大的体外肿瘤模型来评估 T 细胞杀伤效率。但是，传统的 2D 肿瘤模型通常缺乏生物学相关性和复杂性来预测体内或临床结果。 3D 生物打印平台以及许多其他 3D 培养方法，提供了在生理上更相关的组织模型中自动筛选各种分子和药物的潜力。在此，在此概念验证研究中，我们描述了小鼠肺癌的同系生物打印肿瘤模型，以在细胞细胞毒性测定中评估免疫检查点YZ剂（PD-1）。在生物印记的肿瘤中观察到 T 细胞浓度依赖性杀伤， 并且添加免疫检查点抗体进一步增强了 T 细胞杀伤效力。有人建议，生物打印的 T 细胞细胞毒性测定法可能使研究人员能够在更有效的转化模型中筛选检查点YZ剂。

引言

       T 淋巴细胞（T 细胞）在实现对传染病和癌症的长期免疫中起着至关重要的作用。 T 细胞可以在感染或癌细胞表面上的主要组织相容性复合物（MHC）分子的背景下识别特定抗原。这种特异性识别导致 T 细胞分泌有毒颗粒，从而特异性杀死靶细胞。传统上，已经使用在二维（2D）单层中生长的靶细胞进行了 T 细胞杀伤（细胞毒性）测定（Golstein，2018）。这些 2D 分析可通过成像或其他方式快速轻松地进行终点分析。但是，在人体内部，T 细胞介导的靶细胞杀伤发生在三维（3D）环境中，这归因于 T 细胞迁移或渗入 3D 组织核心的其他障碍。因此，3D T 细胞细胞毒性测定法在生理上更相关，并被认为可以更好地预测体内实验的结果。在免疫刺激剂的临床试验中，使用三维肿瘤模型进行细胞毒性试验越来越受到关注。

检查点阻断疗法的ZX发展彻底改变了癌症ZL领域，通过YZ免疫检查点来增强 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤（Topalian，2016）。几种检查点YZ剂，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗体，已被批准用于临床（Sharon，2014 年）。然而，开发高通量 T 细胞毒性测定法以快速和低成本地筛选此类YZ剂的需求仍然没有得到满足。

      已经研究了几种 3D 肿瘤模型，包括球状体、悬滴和微流控芯片模型，用于 T 细胞细胞毒性测定。 例如，胶原蛋白-纤维蛋白凝胶用于在 3D 环境中生长癌细胞，以确定杀死所有癌细胞所需的 T 细胞的JD浓度（Budhu，2010）。最近，微流体球体培养用于免疫检查点封锁的体外分析（Jenkins，2018）。 尽管这些模型在模仿体内环境的某些方面显示出希望，但它们通常通量低或无法考虑细胞外基质（ECM）在肿瘤生物学中的关键作用。

      生物打印是一项新兴技术，使研究人员能够自动化制造肿瘤构建体以筛选抗ai药或免疫刺激剂。该技术沉积了一种充满细胞的 ECM 材料（通常称为生物墨水），与肿瘤细胞混合，随后进行化学或热固化，从而为打印结构提供机械强度。在这里，我们探索了3D T 细胞细胞毒性测定法的生物打印技术的潜力，以帮助评估免疫检查点YZ剂。

材料和方法

细胞准备

为该项目选择了小鼠肺癌细胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 细胞。两种细胞类型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）从美国典型培养物保藏ZX（ATCC）获得，并根据建议的方案进行培养，每 3 至 4 天传代一次。 为了促进活肿瘤细胞的成像，将编码红色荧光蛋白（RFP）的质粒引入 LLC-1 细胞，以生成稳定的 LLC-RFP 细胞。LLC-RFP 细胞（此后称为“LLC-1”）用于其余实验。按照先前发布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培养 OT-1 脾细胞并将其灌注 5 天。 在第 5 天的共培养研究中，未经进一步纯化就使用了引发的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）。

生物墨水的制备和生物打印

中和胶原蛋白 I（CELLINK），并与每毫升胶原蛋白中的 106LLC-1 细胞混合。将所有组件（包括注射器，针头和针尖）置于冰上，直至准备使用。将温度控制的打印头（TCPH）设置为 8°C，而将打印床设置为 10°C。使用 BIO X（软件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中对三维 LLC-1 肿瘤进行生物打印（见图 1）。印刷后，将 96 孔板转移到 37°C 的恒温培养箱中 20 分钟，以使胶原蛋白聚合。接下来，将 200 µL DMEM 培养基添加到每个孔中。 媒体每 3 天刷新一次。 肿瘤生长 5 天，然后与 T 细胞共培养。

图 1. 肿瘤的三维（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用胶原蛋白对 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）进行胶原蛋白印刷。将胶原蛋白液滴（肿瘤）热固化并在 DMEM 培养基中保持 5 天，然后再与 T 细胞共培养。

 在第 4 天，将打印的肿瘤与 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小时，以使肿瘤细胞表达相关抗原。 在第 5 天， 洗涤打印的肿瘤， 并以不同的效应子与靶标（ E∶T） 比

（0∶5）与 T 细胞共培养 48 小时。对于阳性对照，将肿瘤与依托泊苷或 TNFα孵育以诱导细胞凋亡引起的细胞死亡。 阴性对照孔未接受任何 T 细胞或凋亡诱导剂。对于抗原特异性，少数（n = 8）孔中的肿瘤未用 SIINFEKL ZL，但接受了引发的 T 细胞。为了进行免疫检查点分析， 将引发的 T 细胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗体（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）预处理 1 小时，然后将其加入与肿瘤的共培养物中（n = 8）。保留 IgG 同种型对照用于比较。

影像和统计

如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 荧光的损失被用作肿瘤细胞死亡的读数。 使用 EVOS Auto 2 荧光显微镜进行成像。 使用 ImageJ 软件（NIH）测量荧光强度，并使用 Graphpad Prism 8 进行图形翻译和制备。通过使用学生的 t 检验在 Prism 中对统计结果进行统计，数据表示为平均值±SEM。

结果与讨论

肿瘤细胞生长和球状体形成

      BIO X 上的液滴功能能够自动将稳定的胶原蛋白肿瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形状和孔位置的均匀性有助于整个显微镜和分析工作流程。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用 Calcein AM 染色以确定细胞活力。 图 2 中显示的结果表明，LLC-1 细胞在第5 天在打印的肿瘤中是可行的。此外，这些细胞被限制在胶原蛋白内，而不是逃逸其结构以在 2D 表面上生长。

图 2. 肿瘤细胞的生长和生存力。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用钙黄绿素 AM 染色以确定 T 细胞筛选前第 5 天的细胞活力。

3D 中的 T 细胞细胞毒性测定

T 细胞介导的细胞毒性被定量和定性验证。 当将肿瘤与 T 细胞共培养时，观察到肿瘤细胞活力的 T 细胞浓度依赖性降低（见图 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，与无 CTL 对照相比，观察到了肿瘤生存力的统计学显着降低（p=0.0003）（〜30％）。 在存在或不存在 T 细胞的情况下，打印肿瘤的代表性图像显示在图 3B中，当在共培养物中存在 T 细胞时，RFP 荧光显示出质的下降。T 细胞能够附着在胶原屏障上并在 3D ECM 环境中与癌细胞相互作用。

图 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的肿瘤模型进行 T 细胞细胞毒性测定。（A）观察到 T 细胞浓度依赖性地降低了肿瘤细胞的活力，这是通过 RFP 荧光的丧失来确定的。 CTL 的数量代表每孔的总 CTL。 （B）显示了在存在或不存在 T 细胞的情况下打印的肿瘤的代表性图像。 使用相同的采集参数拍摄图像。

免疫检查点测定

为了扩大 T 细胞杀伤的效用或限制，将肿瘤与经抗 PD1 抗体预处理的初免 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。如图 4 所示，与同种型对照相比，使用抗 PD1 抗体阻断 PD-1 / PD-L1 轴显示出 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 检查点的阻滞，引发的 T 细胞能够更有效地附着在胶原蛋白屏障上， 更有效地浸润和杀死肿瘤细胞。

图 4. 免疫检查 （A）显示了免疫检查点阻断测定的示意图。 单克隆抗 PD1 抗体阻断了 PD1 与 PD-L1 之间的相互作用，从而增强了 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力。（B）在 IgG 同种型对照或抗 PD1 抗体存在下，将 3D 生物打印的肿瘤细胞与初免化的 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。 PD1 阻断显示出对靶细胞的增强杀伤作用。

结论

v 3D 生物打印技术可用于 T 细胞细胞毒性测定中，以用胶原蛋白打印 RFP 标记的鼠类肺癌细胞。

v 生物打印的肿瘤细胞在胶原蛋白基质内仍然被限制和存活。 观察到 T 细胞浓度依赖性的细胞毒性增加。

v 如文献所述，抗 PD-1 抗体的使用增强了 T 细胞介导的杀伤效率。

v T 细胞细胞毒性测定与高含量成像工作流程兼容，还可以适应其他肿瘤模型，包括患者来源的异种移植，以加快药物筛选过程并推动个性化药物的临床转化。

v 进一步的研究可能包括通过生物打印的肿瘤细胞对抗原呈递的定量，肿瘤中 T 细胞的浸润以及 T 细胞表达的细胞因子。

v 此外，BIO X 上的多孔生物打印格式可用于扩大对生物试剂（例如免疫检查点YZ剂）和工程 T 细胞（CAR-T）的高通量筛选的支持。

参考文献

1. Budhu, S., Loike, J. D., Pandolfi, A. CD8+ T cell concentration determines their efficiency in killing cognate antigen-expressing syngeneic mammalian cells in vitro and in mouse tissues. Journal of Experimental Medicine. 2010; 207(1): 223–235. DOI: 10.1084/jem.20091279.

2. Golstein, P. and Griffiths, G. M. An early history of T cell-mediated cytotoxicity. Nature Reviews Immunology. 2018; 18(8): 527–535. DOI: 10.1038/s41577-018-0009-3.

3. Jenkins, R. W., Aref, A. R., Lizotte, P. H., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. 2018; 8(2): 196–215. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0833.

4. Nath, S., Christian, L., Tan, S. Y., et al. Dynein seperately partners with NDE1 and dynactin to orchestrate T cell focused secretion. Journal of Immunology. 2016; 197(6): 2090–2101. DOI:10.4049/jimmunol.1600180.

5. Sharon, E., Streicher, H., Goncalves, P., and Chen, H. X. Immune checkpoint inhibitors in clinical trials. Chinese Journal of Cancer. 2014; 33(9): 434–444. DOI: 10.5732/cjc.014.10122.

6. Steff, A.-M., Fortin, M., Arguin, C., and Hugo, P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001; 45(4): 237–243. DOI: 10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AIDCYTO10024>3.0.CO;2-J.

7. Strebel, A., Harr, T., Bachmann, F., et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis. Cytometry. 2001; 43(2): 126–133. DOI: 10.1002/1097-0320(20010201)43:2<126::AID

CYTO1027>3.0.CO;2-J.

8. Topalian, S., Taube, J., Anders, R. et al. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2016; 16(5): 275–287. DOI: 10.1038/nrc.2016.36.

      神经母细胞瘤（Neuroblastoma）是儿童、婴幼儿较为常见的一种颅外肿瘤。其典型的特点是后期恶性化程度较高，预后较差。为保证药物具有针对性，提高治愈率，目前推荐的一个策略是在组织模型中确定病人对该药物的特异性反应。因此，构造一个具有肿瘤微环境的特异性组织模型就显得尤为重要。

     目前，构建肿瘤微环境的一个主要难点在于如何触发其形成血管并发生肿瘤血管化（Tumor-vascularization）。已有的尝试主要为结合内皮细胞和间叶干细胞，使其提供支撑作用并在立体水凝胶中形成血管。

       而在该文献中，作者Daniel Nothdurfter等人将生物3D打印与流体芯片（Fluidic chip）相结合，开发了一种全新的灌注和微血管化的肿瘤微环境模型（Perfused and micro-vascularized tumorenvironment model）。在文章中，作者首先使用激光雕刻聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethylmethacrylate，PMMA）薄片，使其中间具有一个圆形孔（模拟肿瘤微环境）、两侧各有两条槽（模拟血管）；同时，使用regenHU生物3D打印机3DDiscovery BioSafety的细胞亲和性打印头以喷墨的方式将含有细胞的水凝胶均匀喷洒在孔及两侧血管槽内，以形成微环境的主体；为保证血管空腔的形成，作者也使用了牺牲材料Pluronic F-127——一种低温呈液态，高温呈凝胶状的材料——结合打印机的挤压式打印头，在凹槽内铺设血管。之后继续用含有细胞的水凝胶覆盖，降温使Pluronic F-127融化流出，即可得到具有空腔、可流经液体的血管结构（图1、图2）。

图1 文中提到的肿瘤微环境模型构建的三个步骤：激光雕刻流体芯片、生物墨水打印、形成可灌注的血管及肿瘤微环境

图2 左：打印Pluronic F-127后的模型；右：降温去除牺牲材料后，使用染色的PBS进行灌注的效果

      根据该模型结构，作者尝试使用一种明胶-甲基丙烯酸酯（Gelatin-methacrylate，GelMA）与纤维蛋白（Fibrin）混合基质搭配多种类型的细胞，模拟肿瘤微环境；同时，通过添加内皮细胞，以促进微血管的自发形成。结果表明，脂肪细胞（Adipocyte）或诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）来源的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells）都可以诱导肿瘤微环境的形成。另一方面，在去除牺牲材料的管状结构内表面涂上内皮细胞，可生长成致密的血管组织，形成组织屏障。

       之后作者在打印过程中将患者来源的神经母细胞瘤球状体添加到基质里，并培养超过两周的时，成功展示了微血管被肿瘤球状体吸引并生长的过程（图3）；而肿瘤球状体一旦破裂或无法维持球状，则肿瘤细胞会很快入侵周围的微环境（图4）。

图3 添加了神经母细胞瘤球状体（红）的模型基质，分别在第1、6、12、16天的微血管（黄绿）生长情况（比例尺：200 μm）

图4 肿瘤球状体（红）破裂后在微环境中的扩散情况（比例尺：第一行为200 μm；第二行为50 μm）

       小结：该文献介绍了一种微血管化的神经母细胞瘤的肿瘤微环境模型，其特点在于通过生物3D打印，可进行高度定制；同时结合了流体芯片，使其结构更加稳定、统一，形成了一个中等通量的生物制造平台，有利于开展更为复杂、系统的实验，在未来医疗的肿瘤血管生成和转移研究中也能有很大的发挥余地。

       新一代regenHU生物3D打印机保留上一代高精度、高稳定性优势的同时，提供更为简洁的模块化设计，可根据用户应用方向自行定制独特组合功能。设备整体专为生物打印考量，提供从料仓到打印平台全程的细胞生理温度和无菌环境。如需了解细节，请拨打联系电话：021-37827858 或 13818273779（微信同号）。

REGENHU生物3D打印机 R-GEN100 的样机已经到锘海啦！欢迎各位老师前来测样！

介绍和目标

胰 腺四周布满了十二指肠和胆总管等高度血管化的器官。胰 腺癌经常侵袭并转移至周围的器官以及更远位置的器官，例如肝脏、腹膜、肺、大脑、肾脏和骨骼。传统的化疗加放疗或疾病晚期的化疗加靶向药物治 疗可以延长患者的生存期。但是，即使肿瘤局限的患者中，也仅有40%左右的患者能够达到5年的生存期。这就说明亟需为所有胰 腺癌患者改善传统和免疫疗法。肿瘤细胞可以逃避治 疗并继续生长。另外，肿瘤微环境中的基质细胞也是促使持续性肿瘤生长的关键支持土壤。了解肿瘤微环境中的所有细胞的免疫状态对于理解肿瘤转移和改进癌症治 疗方法至关重要，尤其是免疫疗法。

在本研究中，使用了数十个生物标志物研究胰 腺导管腺癌（PDAC）组织中的肿瘤异质性。使用Cell DIVE™超多标组织成像整体分析解决方案，数十个生物标志物可表征肿瘤微环境中的细胞异质性、细胞活性和细胞间的空间位置关系。我们检查了肿瘤、基质各成分和免疫细胞对肿瘤微环境的影响。所使用的生物标志物组合可用于检测肿瘤相关的基质成分和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、血管生成、肿瘤转移、侵袭、炎症、缺氧、代谢和免疫反应。我们发现这些异质性作用经常都是相互影响的。例如，肿瘤内一些分区会适应缺氧条件并因此导致区域内绝大多数细胞增殖失控。另外，这些缺氧区域缺乏免疫细胞。超多标组织全玻片成像支持对肿瘤微环境中的细胞活动进行空间分辨组织分析，包括对细胞间相互作用和组织免疫状态的研究获得全新的认识。

方法和材料

在本研究中，使用商业来源（Pantomics）获得的胰 腺导管腺癌的FFPE样本。抗体经过了严格的标准验证过程（Gerdes等，2013）以确保抗体的结合性能类似于组织一抗/二抗间接标记。本研究中使用了不同供应商提供的三十个生物标志物，均作为商业偶联抗体或者自行偶联。使用Leica Bond（徕卡生物系统）对玻片进行循环染色；在Cell DIVE上使用四通道+DAPI成像玻片，并对图像进行自动化自发荧光移除、校正和拼接。使用徕卡显微系统开发的专 利软件拼接图像进行导入、融合、可视化和分析。该软件将于2023年上半年上市。

结果

使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案，用30个生物标志物循环染色了一个PDAC FFPE切片，确定侵袭性肿瘤细胞的空间状态。本研究中使用的标志物在空间上确定了肿瘤内的代谢和缺氧、凋亡、上皮间质转化和免疫细胞状态（图1 A）。在使用全套30个生物标志物进行细胞分割后，一小部分生物标志物被用来对肿瘤的异质区域进行分类和空间表征（图1B）。具体来说，缺氧标志物Glut1和两个PanCK生物标志物区分出了葡萄糖摄取量增加的癌细胞，这是一个癌症标志。通过这种方式，将肿瘤中侵袭性较强区域的细胞类型与侵袭性较弱区域或正常组织的细胞分开分析，可以减少异质性。量化各区域的免疫贡献，常氧肿瘤和正常胰 腺与缺氧肿瘤区域相比，缺氧区域的淋巴细胞和其他免疫细胞总体减少，尽管所有区域的细胞总数接近（图1D）并显示了代表性的表型图像（图1D底部）。

通过聚类分析无偏差性的确定了细胞亚群。聚类分析和降维显示，与其他区域相比，缺氧肿瘤区域的该细胞群体较少（图2）。与基于表型的免疫细胞计数类似，在缺氧肿瘤区域存在极少的淋巴细胞（图2C聚类和UMAP）。有趣的是，几个聚类显示了具有明显胶原沉积的癌症相关成纤维细胞（CAFs）群体（图2C；橙色方框）。此外，对空间聚类关系的分析清楚地确定了与CAF（肿瘤相关成纤维细胞）在同一空间邻域中常见的细胞类型（图2C；邻域图）。例如，聚类5（SMA+基质集群）和聚类8（免疫细胞；CD45+，胶原蛋白+）是聚类16（SMA+胶原蛋白+；ClAP1+）的共同邻居，表明炎症和肿瘤导致的结缔组织增生通常与PDAC患者的不良生存结果有关2。

结论

我们的研究展示了使用Cell DIVE超多标组织成像分析整体解决方案对单个PDAC切片进行30种生物标志物的循环染色和成像。在肿瘤微环境中，结合使用超多标组织成像和单细胞分析可形成强大的功能，能够在肿瘤的侵袭性区域详细检测单细胞生物标志物的表达。肿瘤微环境中的细胞外基质、和癌症相关的成纤维细胞（CAF）的贡献得到了空间上的确定。

未来的工作将会进一步确定PDAC中的细胞外基质、癌症相关成纤维细胞（CAF）和炎症成分。例如，除了C0L1A1之外，还可以探索其他胶原蛋白、纤连蛋白和SPARC，以及参与CAF浸润和炎症的其他因素。

重要的是，Cell DIVE超多标组织成像整体分析解决方案可以保留组织，生物标志物的表达可以继续在同一组织切片上进行探索，并与研究中所有先前染色的生物标志物重叠。表征肿瘤侵袭性区域的肿瘤微环境有助于阐明导致患者预后不佳的新机制，并有助于发现新的干预措施以提高未来治 疗PDAC的成功率。

参考文献：

相关产品

CELL DIVE 超多标组织成像分析系统

肿瘤细胞在 3D 微环境中生长，与周围环境相互交流、相互作用。细胞行为在 3D 基质中培养与 2D 环境中不同。在许多情况下，3D 细胞培养设置更准确地反映了体内的状况。这包括使用球体和类器官的药物筛选，这些球体和类器官如今作为肿瘤模型是必不可少的。在分析癌细胞行为、迁移、增殖、对药物治疗的反应以及基因和蛋白质表达时，应考虑到这一点。

HT-1080 癌细胞在 3D 胶原蛋白凝胶中的侵袭。 将侵入性人纤维肉瘤癌球体 (HT-1080) 嵌入 I 型胶原蛋白大鼠尾凝胶中。 在 µ-Slide 8 孔中记录侵入凝胶基质 48 小时。 4x 物镜，明场

PDAC细胞和成纤维细胞的类器官共培养。 人yi腺癌 (PDAC) 细胞系 PA-TU-8988T（绿色，用 CellTrackerTM Green 染色）和鼠成纤维细胞系 mPSC4（红色，用 CellTrackerTM Orange CMTMR 染色）在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中的类器官共培养 . μ-Slide 覆盖有 25 μm FEP 箔，用于在直立光片显微镜期间匹配更接近水的折射率。 该图像由 MPI Muenster 的 S. Volkery 使用 M Squared Aurora Airy 光束直立光片设置获取。 样品由德国马尔堡大学的 K. Roth 提供。

用于 3D 癌症模型的 ibidi 解决方案

ibidi Collagen Type I, Rat Tail 是一种非胃蛋白酶处理的天然胶原蛋白，用于在凝胶基质中对 ECM 进行建模。其快速聚合促进了 3D 凝胶中的最佳细胞分布。

µ-Slide Spheroid Perfusion 是一种用于长期球体培养的专用灌流小室。 3 x 7 孔中的每一个都形成了自己的微环境（niche），用于培养标本。通过孔顶部的通道进行灌注（例如，通过使用 ibidi 泵系统）可确保在整个实验过程中实现最佳营养和氧气扩散，而不会使标本暴露在显著的剪切力下。

具有多细胞 µ-Pattern载玻片可实现空间定义的细胞粘附，用于生成球体和类器官、长期培养和高分辨率成像。确定的粘附点能够从细胞悬液中捕获所有粘附的单细胞。周围的 Bioinert 表面是完全不粘附细胞的。这迫使所有细胞在粘附点处相互聚集，从而以明确和可控的方式形成球体。

Bioinert 是一种稳定的生物惰性表面，用于在非粘附表面上对球体、类器官和悬浮细胞进行长期培养和高分辨率显微镜检查，无需任何细胞或生物分子粘附。它目前可作为 µ-Dish 35 mm、高 Bioinert、µ-Slide 8 Well 高 Bioinert、µ-Slide 4 Well Bioinert 和 µ-Slide VI 0.4 Bioinert。

在 µ-Slide III 3D 灌注中，单细胞、球体或类器官可以在凝胶层中或凝胶层上培养或嵌入 3D 基质中。特殊的通道几何形状允许以低流速进行灌注（例如，当使用 ibidi 泵系统时），确保最佳的氧气和营养供应。这种设置使长达数周的长期培养成为可能。此外，薄盖玻片底部可高分辨率成像。

µ-Slide 血管生成和 µ-Plate 血管生成 96 孔是凝胶基质上或凝胶基质中单细胞、共培养物、球体和类器官的 3D 培养和显微镜观察的简单、经济高效的解决方案。凝胶层直接连接到上面的培养基储存器，通过扩散可以快速轻松地更换培养基。对于特殊应用，还可提供带有 1.5H 玻璃底的 µ-Slide 血管生成载玻片。

μ-Slide I Luer 3D 设计用于在具有定义剪切应力的 3D 凝胶基质上或其中培养细胞。三个孔中的每一个都可以填充凝胶，细胞可以嵌入其中。对于定义流量的应用，顶部的通道可以连接到泵（例如，连接到 ibidi 泵系统），以确保最佳的氧气和营养供应。

参考文献：

3D Sandwich culture of squamous cell carcinoma lines using the µ-Plate Angiogenesis 96 Well

Hoque Apu, E., Akram, S. U., Rissanen, J., Wan, H., & Salo, T. (2018). Desmoglein 3 – Influence on oral carcinoma cell migration and invasion. Experimental Cell Research. 10.1016/J.YEXCR.2018.06.037

Breast tumor organoid culture in the µ-Slide Angiogenesis

Lüönd, F., Sugiyama, N., Bill, R., Bornes, L., Hager, C., Tang, F., Santacroce, N., Beisel, C., Ivanek, R., Bürglin, T., Tiede, S., van Rheenen, J., & Christofori, G. (2021). Distinct contributions of partial and full EMT to breast cancer malignancy. Developmental Cell. 10.1016/J.DEVCEL.2021.11.006

Live cell imaging of HT29 tumor spheroid co-culture with neutrophils and NET formation in the µ-Slide III 3D Perfusion

Teijeira, Á., Garasa, S., Gato, M., Alfaro, C., Migueliz, I., Cirella, A., de Andrea, C., Ochoa, M. C., Otano, I., Etxeberria, I., Andueza, M. P., Nieto, C. P., Resano, L., Azpilikueta, A., Allegretti, M., de Pizzol, M., Ponz-Sarvisé, M., Rouzaut, A., Sanmamed, M. F., … Melero, I. (2020). CXCR1 and CXCR2 Chemokine Receptor Agonists Produced by Tumors Induce Neutrophil Extracellular Traps that Interfere with Immune Cytotoxicity. Immunity. 10.1016/J.IMMUNI.2020.03.001

什么是造影剂

      核磁共振成像（MRI)目前普遍应用于医学检测成像中，具有无辐射损伤的安全性，可任意方位断层扫描等技术灵活性，加以涵盖质子密度、弛豫、加权成像以及多参数特征的优势，已成为当代临床诊断中Z有力的检测手段之一，然而临床发现某些不同组织或肿瘤组织的弛豫时间相互重叠,导致诊断困难。因此人们开始研究造影剂，增强信号对比度、提高图像分辨率。其作用主要是通过注射造影剂来改变组织局部弛豫特性，提高成像对比度，从而提高诊断的准确性。

      造影剂是一类化学合成的其密度高于活体组织的物质，造影剂本身不产生信号，通过改变体内局部组织中水质子的弛豫效率，与周围组织形 成对比，从而达到造影目的。

造影剂的原理

      带有磁性的物质如Fe、Mn、Gd等，具有多个不成对的电子，当这些物质接近共振中的氢原子时，能有效地改变质子所处的磁场，造成T1和T2弛豫时间明显缩短。造影剂能改变体内局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常与患病部位的成像对比度和分辨率，为病变定位和诊断提供更多的信息（图1和图2所示）。

      MRI造影剂又为顺磁性或超顺磁性物质，能同氢核发生磁性的相互作用，他们进入动物体内，将引起纵向弛豫速率（1/T1)和横向弛豫速率（1/T2)的改变，在顺磁物质的作用下，其抗磁和顺磁贡献具有加和性，即：

(1/Ti)观察=(1/Ti)抗磁+(1/Ti)顺磁 , (其中i=1,2)

在不存在溶质之间相互作用的情况下，溶剂的弛豫速率与所加的顺磁物质的浓度（mol/L)成线性关系，即：

(1/Ti)观测=(1/Ti)抗磁+求和ri[C] , (其中i=1,2)

其中ri为顺磁物质的弛豫效率（Relaxivity，单位mmol/L·s），求和是针对溶液中造影剂的种类而言，T1类型造影剂，如Gd类配合物，成像时相关部位变亮，又称为阳性造影剂；T2类型造影剂，如基于Fe3O4离子的超顺磁性造影剂，成像时相关部位变暗，又称为阴性造影剂。

造影剂的应用：

弛豫效率是MRI造影剂关键指标之一。弛豫效率高的样品，可以使用Z少的量达到Z好的效果；在造影剂研究领域，纽迈专门开发了小型的核磁共振成像分析仪，可测试方便的测试造影剂T1、T2弛豫时间，并可对试管样品进行成像，提供定量和定性评价数据，为造影剂产品的研发与改进提供快速可靠的检测手段。

造影剂在体内的作用评价：

造影剂在肾脏中的代谢过程监测，该造影剂在小鼠体内肾脏部位代谢时间超过250min,且作用顶峰时间约在注入后130min。 

在生物医药领域，低场核磁共振可为您提供以下科研方案

1)造影剂研究：弛豫率 效能评价 体内代谢评价；

2)体表肿瘤研究：造影材料作用 药物靶向 肿瘤药效评估;

3)原位肿瘤研究：位置排查 转移判断 尺寸测试；

4)清醒动物体成分分析：瘦肉 脂肪 自由水含量 脂肪分布；

（来源：苏州纽迈分析仪器股份有限公司）

本文展示了如何使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）实现尤文（尤因）肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节观察，从而协助本研究的进行。活细胞成像等技术在了解肿瘤进展和转移研究中至关重要。真核细胞中的有丝分裂纺锤体由中空的微管组成。它在有丝分裂期间的细胞内重复染色体分离和分裂细胞细胞骨架结构的构建过程中发挥着重要的作用。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认。

简介

使用荧光显微镜可以研究肿瘤形成和进展过程中组织及细胞内部发生的变化。像活细胞成像这样的技术对更加深入地了解肿瘤进展和转移是至关重要的。

在真核细胞中，由中空微管组成的有丝分裂纺锤体，有助于构建复制细胞的细胞骨架结构，并在有丝分裂过程中将复制的染色体从原始细胞中分离出来。在尤文肉瘤这一类的肿瘤细胞中，有丝分裂障碍的触发因子可通过检查有丝分裂纺锤体的机能障碍来得以确认[1]。

肉瘤是肌肉或骨骼等结缔组织中形成的一类肿瘤。尤文肉瘤和横纹肌肉瘤，分别生长于骨骼和肌肉中，是一种倾向于发生在骨骼生长活跃区域附近的儿科肿瘤。除了手术和化疗之外，电离辐射也被用于治疗这类肿瘤，但这可能会导致生长中的骨骼受到永jiu性损伤，包括不对称生长停滞、胫骨畸形及骨折概率增加等。骨骼损伤的严重度在很大程度上与骨骼接受的辐射剂量成正比。因此，我们有理由认为，选择性放射致敏肿瘤组织的策略可降低实现局部控制所需的辐射剂量，并能最大限度降低对邻近健康组织造成的间接损伤。

运用体外研究和小鼠异种移植模型系统，对使用mRNA合成抑zhi剂光神霉素A预处理，可以通过改变辐射损伤的转录反应实现选择性放射致敏EWS：Fli1+肿瘤细胞的假设进行了验证[2]。结果表明，光神霉素A可以通过抑zhi参与DNA损伤修复相关基因的转录，使EWS：Fli1+细胞在体内外显著放射增敏，导致肿瘤细胞程序性死亡[2]。

使用THUNDER Imager Tissue和Large Volume Computational Clearing（LVCC）可以揭示肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节，协助癌症研究人员获得更有用的见解。

挑战

在有丝分裂纺锤体成像中，可对其实现快速成像，并获得清晰的高对比度3D成像，以清晰展示重要细节的解决方案最为实用。传统的宽场显微成像速度快，检测灵敏度高，但不幸的是对于厚样本的成像通常会出现失焦不清晰或模糊的情况，这会降低对比度[3]。要阐明有丝分裂的不稳定性在癌症等复杂疾病中的作用，这需要在同一样本中进行多个关联生物学标记。

方法

该研究中使用了尤文肉瘤细胞（SK-ES-1）。对这些细胞进行α-微管蛋白（Clone YL1/2 Thermo-Fisher Scientific # MA1-80017，按1:500比例稀释/ Dylight 488偶联驴抗大鼠 Thermo-Fisher Scientific #SA5-10026）、γ-微管蛋白（Clone TU-30，AbCam # ab27074，按1:200比例稀释/Dylight 550偶联驴抗小鼠 Thermo-Fisher Scientific # SA5-10167）和DNA（Hoechst 33342蓝）进行染色。染色后，使用介质ProLong Glass Antifade（Thermo-Fisher Scientific #P36981）进行盖玻片封片，并通过使用63×/1.4 NA（数值孔径）的油镜进行THUNDER Imager Tissue成像。图像采集使用大体积成像解析（LVCC）[3]模式，并生成最大化投影图像数据。

结果

在有丝分裂过程中，α-微管蛋白（绿色）形成有丝分裂纺锤体，染色单体（蓝色）会附着在有丝分裂纺锤体上，而γ-微管蛋白（红色）集中定位在分裂细胞中的纺锤极上。通过THUNDER技术可观察到肉瘤细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。清晰的图像可以展示清晰的结构，以便进行分割和进一步的分析。

图1：尤文肉瘤细胞SK-ES-1 α-微管蛋白（绿色）、γ-微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）染色后的最大化投影：原始图像数据（左）和THUNDER LVCC模式成像数据（右）。

 结 论 

THUNDER Large Volume Computational Clearing（LVCC）[3]进行尤文肉瘤细胞中的有丝分裂纺锤体成像时可显著增强对比度。与传统的宽场成像相比，其可展示细胞中有丝分裂纺锤体的更多细节。

References：

1.S. Rello-Varona, D. Herrero-Martín, L. Lagares-Tena, R. López-Alemany, N. Mulet-Margalef, J. Huertas-Martínez, S. Garcia-Monclús, X. García del Muro, C. Muñoz-Pinedo, O. Martínez Tirado, The importance of being dead: cell death mechanisms assessment in anti-sarcoma therapy, Frontiers in Oncology (2015) vol. 5, p. 82, DOI: 10.3389/fonc.2015.00082.

2.M. Yun Lin, T.A. Damron, M.E. Oest, J.A. Horton, Mithramycin A Radiosensitizes EWS:Fli1+ Ewing Sarcoma Cells by Inhibiting Double Strand Break Repair, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. (2021) vol. 109, iss. 5, pp. 1454-1471, DOI: 10.1016/j.ijrobp.2020.12.010.

3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note : THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.

相关产品

THUNDER Imager Tissue全景组织显微成像系统

 内容介绍

微组织阵列技术结合组织工程学、生物材料学、细胞生物学及药学等交叉前沿学科，在体外构建仿生生理、病理微环境。3D体外仿生生理、病理微组织模型更似体内，为提高前期药物筛选效率、发现新基理、实现jing准ZL提供有效的研究工具。本次网络讲座将介绍该技术在肿瘤和纤维化药物筛选和临床用药指导中的应用。

讲座题目：3D仿生生理和病理微组织阵列技术助力药物研发和临床ZL

讲座时间：2019年4月11日14:00-15:00

讲座形式：网络讲座，只需要手机或PC即可参与（会前通过短信和邮箱发送会议链接）

听干货讲座，赢精美礼品！

我们将从直播参会者中抽取5名幸运儿送出我们的精美礼品——天堂雨伞哦！

即刻扫码报名

讲师介绍：

微透镜

(a) 为微透镜的大视野3D图像，通过hitachi MAP 3D 将多张3D 图像拼接而成。

(b) 为（a）中红框部分的形貌像。通过颜色标尺很容易确定高度信息。

(c)(d)是提取的图.1(b)中划线区域的结果，可以获得每个透镜（箭头 0-1, 2-3）的水平距离、垂直高度以及顶部和底部的角度。

所以，使用Hitachi Map 3D可以获得大视野3D图像和截面轮廓信息。

(a)拼接后的3D图像(x2k), (b)红框内的形貌图

（c）(b)中划线区域的截面

观察机型：FlexSEM1000 

观察条件：5 kV, 2000倍, 30Pa 软件：Hitachi Map 3D

Material

【大视野3D观察】

FlexSEM1000