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众所周知，脊柱是身体的支柱，那么你了解脊柱具体由哪些结构组成吗？脊柱与脊髓之间又有什么关联呢？



一．脊柱的结构与功能



脊柱分颈椎、胸椎和腰椎，颈椎有生理前曲，胸椎后曲，腰椎前曲。简单来说，脊柱从侧位看，呈S状，此形状可以很好地吸收人体走路、跑跳带来的冲击和震荡。

图1 脊柱结构图

脊柱由脊椎骨及椎间盘构成，是一相当柔软又能活动的结构。随着身体的运动载荷，脊柱的形状可有相当大的改变。脊柱的活动取决于椎间盘的完整，相关脊椎骨关节突间的和谐。


脊柱具有支持躯干、保护内脏、保护脊髓和进行运动的功能。 脊柱内部自上而下形成一条纵行的脊管，内有脊髓。
 



二．脊髓的结构与功能


脊髓(Madulla spinalis)是zhongshu神经的低级部分，由胚胎时期神经管的后部发育而成，仍保持节段性。脊髓发出脊神经分布于躯干和四肢，是躯干和四肢的初级反射zhongshu；内含许多上、下行传导束，与脑部各级神经有着广泛的联系，是联系躯体和脑部的枢纽，在正常情况下，脊髓的活动总是在脑的控制下进行的。
脊髓位于脊柱的椎管内，上端与脑相连，下端与DY腰椎下缘平齐。脊髓是脑与躯体、内脏之间的联系通道。
(1)脊髓的结构
从脊髓的横切面可以看出，脊髓包括灰质和白质两部分。灰质在ZY，呈蝶形;白质在灰质的周围。白质内的神经纤维在脊髓各部分之问以及脊髓和脑之间，起着联系作用。

图2 脊髓结构图

(2)脊髓的功能
反射功能：人的脊髓灰质里有许多低级反射，可以完成一些基本的反射活动，如膝跳反射、排便反射等。但是，脊髓里的神经是受大脑控制的。
传导功能：脊髓能对外界或体内的刺激产生有规律的反应，还能将这些刺激的反应传导到大脑。反之，脑的活动也要通过脊髓才能传递到身体各部位。因此脊髓是脑与躯干、内脏之间联系的通道。
 



三．平铺光片显微镜下的脊柱连脊髓样本3D重构
LS18光片显微镜不仅可以对脑，心，肝，脾，肺，肾，卵巢等软的小组织样本进行成像，它同样可以对超过2cm的超长样本组织进行成像，如脑连脊髓，小鼠骨架，小鼠小肠，小鼠长脊柱等等。如下图3所示，为小鼠的脊柱样本血管成像3D重构结果。该脊柱整体长约6cm，成像分辨率为横向3.3µm，纵向7µm，整个样本成像时长约7小时。

 图 3 小鼠长脊柱血管整体3D重构

图4 局部细节展示（XY面层切）

图5 局部细节展示（XZ面层切）

锘海生命科学不仅自主研发出专门对大样本组织成像的平铺光片显微镜，同时还依托于显微镜测样服务工作积累了丰富的组织透明化、组织免疫荧光染色及成像经验，甚至我们的工程师还精心优化了透明化样本制备配方，自主研发出快速GX的锘海组织透明化试剂盒，如图6所示，它可适用于不同的样本组织类型，大大提高样本组织透明化的效率，从更专业的角度为广大科研工作者制定一套完整的服务解决方案，助力每一位生命科学工作者完成使命！锘海生命科学，助力科研人真正地回归科学！

图6 锘海组织透明化试剂盒

锘海一站式科研服务——让科研变得更简单
锘海生命科学为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过JZ、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

了解更多锘海LS18平铺光片显微镜相关信息请联系 021-37827858、13818273779（微信同号）

脂肪组织在机体能量稳态调控和体温调节中发挥着重要的作用。脂肪组织由不同类型的脂肪细胞以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管和神经投射物组成。目前分析脂肪组织的免疫组织化学和免疫荧光方法主要是基于对具有相对高倍率成像的薄切片。然而，这种方法存在着明显的局限性。首先，复杂的丝状结构，如交感神经和脉管系统，已知在脂肪功能中起着重要的作用，薄切片仅捕获一小部分组织，这可能导致结论因分析的组织部分不同而产生差异，很难通过薄切片进行评估。其次，由于脂肪组织独特的无定形形态特征，很难仅根据切片染色来评估脂肪组织的三维结构。鉴于这些因素，非常需要一种可提供整个脂肪组织的三维可视化并且保持高分辨率的方法。

锘海生命科学自主研发的平铺光片显微镜具有三维成像速度快、对比度高、低光毒性、低光漂白等诸多优点。此外，依托于显微镜测样服务工作积累的丰富的组织透明化、组织免疫荧光染色及成像经验，锘海生命科学自主研发出了快速高效的锘海组织透明化试剂盒，大大提高样本组织透明化的效率，为广大科研工作者提供一套更为专业、完整的服务解决方案！

我们使用TH对脂肪组织的神经进行标记，如下图1、2所示，为小鼠附睾脂肪神经成像3D重构结果。该脂肪组织大小为6.0x8.5x2.5 mm，成像分辨率为横向4 μm，纵向10 μm，成像时长仅4分钟。

图1 小鼠附睾脂肪组织神经成像

图2 小鼠附睾脂肪组织神经成像（局部图）

我们使用SM22对脂肪组织的大血管进行标记，如下图3、4所示，为小鼠附睾脂肪组织大血管成像3D重构结果。该脂肪组织大小为6.0x8.5x4.0 mm，成像分辨率为横向2 μm，纵向10 μm，成像时长仅10分钟。

图3 小鼠附睾脂肪组织大血管成像

图4 小鼠附睾脂肪组织大血管成像（局部图）

参考文献：

[1] Chi J, Crane A, Wu Z, Cohen P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. J Vis Exp. 2018 Jul 28;(137):58271. doi: 10.3791/58271. PMID: 30102289; PMCID: PMC6126572.

[2] Wang P, Loh KH, Wu M, Morgan DA, Schneeberger M, Yu X, Chi J, Kosse C, Kim D, Rahmouni K, Cohen P, Friedman J. A leptin-BDNF pathway regulating sympathetic innervation of adipose tissue. Nature. 2020 Jul;583(7818):839-844. doi: 10.1038/s41586-020-2527-y. Epub 2020 Jul 22. PMID: 32699414.

神经系统是机体内对生理功能活动的调节起主导作用的系统。近年来，随着显微成像技术的快速发展，神经细胞和神经网络的研究已成为学术科研领域的热门研究。为寻求对神经组织更好的染色方案，锘海LS18测样服务中心对小鼠多个器官的神经组织进行透明化TH染色预实验，并通过LS18平铺光片显微镜上的快速扫描成像，得到了以下结果。 在神经科研领域中，对神经走向的研究，离不开对神经细胞和神经网络的观察。锘海LS18测样服务部，致力于为客户带来优质的服务，团队对小鼠的多个器官组织都进行了神经TH（Tyrosine Hydroxylase）染色，总结得到更好的染色方法，对客户样本负责，更是对自己负责！  

 
如今，我们已完成多种小鼠器官组织在LS18平铺光片显微镜上的快速扫描成像，现分享近期成像结果。 

• 小鼠肺神经染色，3.2x快速成像结果展示，如图1及图2所示：

图1 小鼠肺神经成像-volume展示 

图2 小鼠肺神经成像-200um层切局部高清展示

• 小鼠肝脏神经染色，3.2x快速成像结果展示，如图3及图4所示：

图3 小鼠肝脏神经成像-volume展示

图4 小鼠肝脏神经成像-200um层切局部高清展示

• 小鼠心脏神经染色，3.2x快速成像结果，如图5及图6所示：

图5 小鼠心脏神经成像-volume展示

图6 小鼠心脏神经成像-200um层切局部高清展示

• 小鼠肾脏神经染色，3.2x快速成像结果，如图7及图8所示：

图7 小鼠肾脏神经成像-volume展示

图8 小鼠肾脏神经成像-200um层切局部高清展示

锘海生命科学凭借平铺光片专利技术，自主研发生产LS18平铺光片显微镜 (Tiling Light sheet Microscope) 是一款适用于各类透明化大组织样品及活体模式生物长时程动态监测的选择性平面照明显微镜，可在细胞级甚至亚细胞级水平上快速、低光毒性获得多色荧光标记结构的精准3D空间分布。 作为生产商，我们不仅提供成像仪器，亦提供科研服务平台。为各地高校、科研院所、医院及企业提供从 组织透明化 → 免疫荧光染色 → 大样品高分辨3D显微成像 → 大数据分析一体化服务。

另依托公司测样服务中心丰富的实验经验和LS18平铺光片显微镜的成像优势，现已推出自主研发的锘海透明化试剂盒。除此之外，免疫荧光染色试剂盒也即将问世，敬请期待！ 锘海旨在通过精准、快速、多样化的研发服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化解决方案。 

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电话：021-37827858、13818273779（微信）

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2022年9月27日，学术期刊《Cell Reports》在线发表，南京农业大学动物医学院青年教师李昱辰为通讯作者，其团队研究成果“ Bacillus subtilis programs the differentiation of intestinal secretory lineages to inhibit Salmonella infection ”。

肠道黏膜可以抵抗病原菌的入侵，是机体的重要保护屏障。在Notch、BMP及Wnt等信号通路的共同协调下，肠道干细胞（Intestinal stem cell，ISC）能够向分泌型或吸收型谱系定向分化，来维护肠道的稳态。肠道干细胞与机体其他类型干细胞不同，能够持续与肠道微生物发生直接或间接的接触。因此，解析微生物群与肠上皮分化命运之间的关系，是有效维持病原菌应激下肠道稳态的关键。

该研究成果是继复旦大学医学院神经生物学国家实验室何承峰后用锘海LS18光片显微镜发表“ Knockdown of NRSF Alleviates Ischemic Brain Injury and Microvasculature Defects in Diabetic MCAO Mice” 研究成果后的另一佳作。

该研究探讨了枯草芽孢杆菌对肠上皮分化特别是分泌细胞命运的调节作用，以及对肠黏膜屏障完整性的保护作用，发现了活的枯草芽孢杆菌能刺激小鼠肠类器官和回肠内肠分泌细胞的分化。这些作用被DLL4的添加所抑制，表明枯草芽孢杆菌遏制Notch通路以减少Hes1的表达，从而使ISC分化向分泌细胞方向转变。枯草芽孢杆菌，影响ISC的分化和增殖，以保护黏膜屏障，可调节宿主肠上皮Notch信号通路，为促进肠道健康提供了巨大的潜力。

文章链接: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111416

锘海LS18光片显微镜—专为透明化样品设计的高速高分辨三维荧光显微镜成像系统

针对大组织样品的3D荧光成像，采用与西湖大学高亮（平铺光片技术发明人）实验室共同研制的光片显微镜Nuohai LS 18，其运用创新的平铺光片技术，克服了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，从而获得均匀高分辨率的3D荧光图像，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学、组织病理诊断等各个领域。

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2022年5月13日，国际学术期刊《Frontiers in Neurology》在线发表了复旦大学医学神经生物学国家重点实验室郭景春教授为第一通讯作者，何承峰为第一作者的研究成果“ Knockdown of NRSF Alleviates Ischemic Brain Injury and Microvasculature Defects in Diabetic MCAO Mice ”。 

糖尿病（diabetes mellitus，DM）不仅是影响世界数亿人的主要健康问题之一，也是公认的脑卒中危险因素之一，越来越多的证据还表明糖尿病与更糟糕的脑卒中预后有关，例如认知障碍和痴呆。然而糖尿病及脑卒中后不良预后的生物学机制仍不清楚。

NRSF即神经元限制性沉默因子（neuron-restrictive silence factor），又称为REST（repressor element-1-silencing transcription factor，抑制元件1-沉默转录因子），是一种重要的锌指蛋白转录负调控因子，它与神经元限制性沉默元件（neuron restrictive silencer element，NRSE），或称抑制元件1（repressor element 1，RE-1）相结合，调节靶基因的转录。NRSF 在多种神经系统疾病的发展和进展中发挥重要作用，例如缺血性脑卒中、阿尔茨海默病和帕金森病等。先前的研究表明，NRSF在糖尿病和缺血性脑卒中表达升高，而NRSF 在调节糖尿病缺血性脑卒中的作用也尚未完全清楚。本文作者通过高脂饮食和大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）建立糖尿病缺血性脑卒中小鼠模型（DM+MCAO），发现糖尿病增强了MCAO诱导的海马NRSF的升高，此外DM+MCAO小鼠的神经元损伤和学习/记忆障碍加重，血脑屏障（blood brain barrier，BBB）完整性和脉管系统疾病也进一步恶化。作者进一步利用重组腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）shRNA-NRSF基因干扰载体（sh-NRSF），发现NRSF敲低可改善糖尿病加重的缺血性脑损伤，也减轻了由此引起的海马神经元损伤，并可保护微血管免受糖尿病缺血性损伤。由此可见，转录因子NRSF的升高可导致糖尿病缺血性海马中更大的神经元损伤和脑微血管缺陷，为糖尿病性脑卒中的治疗实践提出了新的候选靶点NRSF。

该研究成果是本月继浙江大学医学院脑科学与脑医学系、良渚实验室研究员，浙大二院双聘教授刘冲团队使用锘海LS18平铺光片显微镜在Nature发表“ Olfactory sensory experience regulates gliomagenesis via neuronal IGF1（点击链接看文章详情）” 研究成果后的另一佳作。

该文对糖尿病缺血性脑卒中模型（DM+MCAO）小鼠，通过股静脉注射Lectin染料并对全脑样本进行组织透明化处理后使用了锘海LS18平铺光片显微镜进行3D成像。

原文Fig. 6 A-D采用锘海LS18平铺光片显微镜对sh-NRSF及其对照组进行全脑3D荧光成像（红色：Lectin; 绿色：GFP标记AAV shRNA），尽管两组的对侧海马体积大致相等，但是病毒注射同侧海马体积sh-NRSF约为对照组的1.5倍。

原文Fig. 7 对Lectin标记全脑微血管的3D荧光成像结果进一步评估病毒注射同侧海马血管的荧光分布（A，C：CA1-CA2；B，D：CA3）、体积（E，F）、长度（G，H）和分支点（I，J），各指标显示sh-NRSF相对于对照组均有所改善。

文章链接: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fneur.2022.869220/full

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生物组织由各种具有不同光学特性的物质组成，因此，当光线穿过组织时，光分布和光强度由于光散射和光吸收等因素的影响而衰减，从而导致图像模糊或减弱，尤其是在组织深层区域更是显著。即此，组织透明化的目的是尽量减少光的散射和吸收，以获得更好的光学成像性能。有效的组织透明化有助于提高成像深度和对比度，使完整器官甚至啮齿类小鼠样品的全身3D成像成为可能。

从技术上讲，所有成像步骤的目标是期望以高通量方式拍摄理想分辨率（细胞到亚细胞）的细胞/器官/组织/完整实验模型图像。在众多的成像技术中，光片显微镜（LightSheet Mciroscope, LSM）因其优异的光切成像能力和高质量的成像速度而特别适用于透明化组织或模式生物的 3D成像。实际图像采集及应用中，应根据实验需求平衡图像质量、采集数据量和采集时间，不言而喻更高分辨率的图像会增加数据量及采集时间。而随着检测物镜NA值的增加，横向分辨率比轴向分辨率增加得更快，这使得保持空间分辨率各向同性变得更加困难。所以，LSM实际使用过程如何根据实验需求选择合理拍摄条件尤为重要。

锘海LS18平铺光片显微镜不仅可以实时预览和自动校准光片，且可以根据用户成像应用需求灵活调整平铺光片数量（1-10 tile），以满足快速和高分辨成像的不同需求。通常在某一放大倍数下，通过选择合适的平铺次数得到的轴向分辨率，以接近横向分辨率即可实现空间分辨率的各向同性，这种性能对于重要结构信息的判断尤为重要，对于原始信号的保真性也尤其重要，可以更大程度的减少光学畸变对原始信号的影响及数据的解读、分析。

LS18平铺光片显微镜具有各向同性分辨率的成像能力，但我们建议用户应在特定应用中合理地选择空间分辨率及平铺次数，兼顾数据存储、软件图像处理能力和数据分辨率之间的平衡，毋庸赘述图像采集时间和数据量随3D 空间分辨率和组织大小成比例增加。锘海LS18平铺光片显微镜给予客户更大权限的选择，可灵活选择少量平铺、不平铺传统光片成像模式，可有效提高成像效率、缩短成像时间、减轻对数据存储和处理压力，对于仅仅是简单定性或分辨率要求不高的成像实验相对高效。同时亦可以选择多次平铺的独特模式，可以有效提升采集信号的各项等性空间分辨率，满足高质量数据的解读需求，此类模式在同等空间分辨率条件下，成像效率、成像时间显著优于传统光片对数据的采集。

通过比较图像采集和图像重建过程，可以清楚地揭示使用常规光片显微镜和平铺光片显微镜在相同空间分辨率下对相同样本体积进行成像的不同效率。

• 针对大组织样本成像时，传统光片显微镜空间分辨率和成像视野之间存在矛盾

• 镜锘海LS18 平铺光片显微镜，在保持大的成像视野、快的成像速度的情况下

  使用薄的光片厚度，实现大组织样本高分辨率成像

以往我们的标准配置以高质量的各向同性分辨率成像设置（标准模式）为主，目前考虑到客户多样化的需求，更加灵活的专家模式即将开放给广大用户。以下展示一组成像结果的对比用于说明不同平铺次数成像模式之间的差异，可以让大家更直观地了解平铺所带来空间分辨率优势所在：

使用锘海LS18平铺光片显微镜对透明化Thy1-eGFP 小鼠脊髓成像（6.3X），分别使用平铺6次（6 tile，上行图像）和1次（1 tile，下行图像）模式进行对比，如图横向（A-B）和轴向（C-D）更大强度投影（MIP）。（C）和（D）中选定区域（黄色）的放大视图分别为（E）和（F），即使是较小胞体的形态在6 tile模式下依旧清晰可辨，但是在1 tile模式下会丢失部分信息，但是毫无疑问1 tile的速度相比于6 tile模式至少可提升6倍之多！

平铺 LSM 比传统 LSM 更有效地对具有高空间分辨率的透明化组织进行成像，因为通过平移光片而不是样本来减少对样本的扰动，这样更快、更准确、更灵活。锘海LS18平铺光片显微镜可以与所有组织透明化方法兼容，并且可以灵活地满足不同的成像需求，可通过相位调制对光片进行自动校准，因此也很可靠且易于操作。

锘海LS18平铺光片显微镜不仅注重3D成像能力，满足从透明化大组织中获得所需的数据，同时还注重优化和调整成像性能的能力，使得显微镜更灵活的兼容各类应用场景。与其他光片显微镜不同，LS18平铺光片显微镜采用专利的光学设计和相位调制方法，使其在透明化组织成像方面的能力、可靠性和灵活性更高。与其他光片显微镜相比，LS18平铺光片显微镜具有多项先进功能：首先，基于自主研发的平铺专利技术，与传统 LSM 相比，平铺光片用于样品照明时空间分辨率和成像效率可以同时得到提高，解决空间分辨率与丞相速度之间的矛盾。其次，检测物镜NA、检测放大倍率和激发光片平铺次数可轻松调节，使显微镜能够以微米级到亚微米级的空间分辨率对厘米级的透明化组织进行3D成像。第三，由二进制空间光调制器 (SLM) 进行相位调制生成的照明光，可满足样品照明时灵活的的平铺光片数量需求，且调制便捷只需要软件参数设置，无需任何硬件调试。此外，通过 SLM 的相位调制，可校正几乎所有的对准误差，这重要的保障了光片显微镜成像性能的稳定性及成套系统可靠性。显微镜与所有组织透明化方法兼容，并且很容易适应通过不同方法得到的不同形状和机械强度的组织成像。

参考文献

Chen Y, Li X, Zhang D, et al. A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues. Cell Rep. 2020;33(5):108349. doi:10.1016/j.celrep.2020.108349

Susaki EA, Ueda HR. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chem Biol. 2016;23(1):137-157. doi:10.1016/j.chembiol.2015.11.009

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2022年7月8日, 锘海线上直播围绕LS18平铺光片显微镜技术、生物组织透明化技术、测样服务平台以及LS18平铺光片显微镜应用案例等主题进行报告和展示。在报告互动环节中，各位老师就目前课题方向提出诸多代表性疑问，让我们一起回顾下精彩问答。

Q: 什么是平铺光片技术？以及该技术的控制的原理是怎样的？

A：平铺光片技术是一种新型的选择性平面照明显微镜（SPIM）三维成像技术，在不增加光片厚度、不降低激发光片约束能力的情况下，增加SPIM的FOV。如图1所示，在探测焦平面内沿光片长轴方向(y方向)平铺小而薄的光片，在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合并重建整个FOV的图像。 

平铺光片技术的控制原理：

在成像时，无论是通过移动物镜或是移动样本等物理方式，都会影响成像质量，造成artifacts。LS18光片显微镜创新地采用平铺光片模式，通过对空间光调制器加载不同的相位图以对激发光束进行调制，实现快速平铺短而薄的光片，扩大了FOV且不影响空间分辨率和光学层析能力，从而获得均一的高分辨率3D图像。空间光调制器对激发光相位进行调制几乎可以解决所有的光片校准问题，真正地实现显微镜仪器的自动校准，并且性能非常稳定，易于操作和维护。另外，根据不同样品的研究需求，LS18光片显微镜能够灵活地调整光片平铺次数以及成像速度，实现不同类型的完整组织器官的3D结构与功能测量。

图1. TLS-SPIM的工作原理，（左）通过快速平铺小而薄的光片，（右）在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合重建整个FOV的图像，使得视野范围内各处成像分辨率均一。

关于平铺光片技术的详细原理可参考以下文献：

1. Gao, Liang. Extend the field of view of selective plan illumination microscopy by tiling the excitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2. Fu Q , Martin B L , Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications, 2016, 7:11088.
 

Q: 用lectin标记血管时，是尾静脉注射后再取器官然后透明化，还是先透明化再用染色仪器将lectin标记上?
A: 血管标记透明化和染色顺序问题，在实验案例当中，两种方式我们都有尝试过，实际上它都是可行的。首先，lectin的尾静脉注射方式对整个灌注流程来说，需要非常大的技术把控性。如何做到良好的静脉内注射并维持小鼠一定时间的存活率，对于实验室新手可能需要多加练习。由于lectin具有半衰期，可参考发表文献中的操作步骤，根据代谢动力学来选择一个合适的时间，需要注意的是在灌注流程过程当中剥离取材时间或者说lectin的孵育时间。同时，有些客户送到我们这边的样本可能在前期经过灌注后会产生荧光淬灭的问题，我们可以选择性帮老师做巩固结构及加强染色步骤。对于加强染色这部分，可用lifecanvas 的SmartBatch+主动式透明化/染色一体电泳仪，亦可采用传统的被动渗透式方法来实现。

Q: 请问哪种透明方法和免疫染色结合的比较好?
A: 透明化方法和免疫染色的结合目前为止没有好坏之分，大组织样品免疫染色目前是世界性的难题，从目前众多老师和我们测样的经验来看，油性染色方法中idisico和Pegasos的方法都比较可行，但是idisco涉及甲醇的脱水步骤，所以对抗体和甲醇的兼容性要求比较高，有条件的用户我们建议可以先做个兼容性测试，这样有助于提升后期染色的效率。

通常来说，荧光基团在水性的环境当中保存性更好。所以，如果样品可以满足水性透明化方法的前提下，可以尽量尝试采用水性透明化方法，同时关注指标染色特异性及有效性。

此外，大组织免疫染色还与样品大小有关。在不同组织中，如：对于肠道、肺、整脑、整个脑连脊髓、心脏等各类样品，方法和步骤都有区别。所以透明化方法一定要和免疫染色指标综合考虑，才能寻找”更优解“，跟我们目前有限的经验，需要根据样品和染色指标来进行综合筛选，寻找合适的组合。

Q: matrigel细胞外基质胶可以通过哪几种透明化方法处理？
A：涉及matrigel细胞外基质的样品一般多是类器官样品，此类样品可以通过多种方法透明进行透明化和染色。因为这类样品相对whole tissue来说一般体积较小，所以这个情况下，实际上有多种透明化方法可尝试，甚至可以结合我们更新的膨胀技术达到纳米级别的分辨，在3D纳米级水平完整展示整个类器官样品形貌。为方便广大科研老师，我们锘海依托大量实验案例开发出的组织透明化试剂盒（#NH-210701）就可以应用于类器官的透明化，试剂盒附有详细实验步骤可供老师选择。

Q: 采集的图像信息量很大，如何进行数据处理？大量的光学切片需要拼接，软件怎么选择？另外，用什么软件实现细胞分割和单细胞追踪？定量分析可以采用第三方软件吗？图像输出是什么格式？

A：平铺光片显微镜采集的大样本成像数据量能达到几百GB或TB级别，可通过锘海自主研发的数据预处理软件对采集图像预处理，输出.3dtiff格式的原始数据供第三方数据分析软件调用（如图2所示）。通过第三方软件或自主拼接软件即可实现将所有ROI数据都拼接在一起，得到一个完整样品的3D数据（如下图所示）。

图2. 平铺光片经数据提取后得到全视野高分辨率的图像

目前能实现3D大图拼接的第三方软件有很多，如Amira、Imaris，均可以对.3dtiff格式原始数据进行处理，可实现常规的单个区域数据结果快速查看、单个区域数据动态展示、大样本数据整体拼接、大样本组织整体图像处理及展示等操作。另外，3D成像的数据处理对电脑性能配置也有一定的需求，一般推荐128GB以上内存，4T以上的SSD，并需配备较高性能独立显卡。

上述这些第三方的专业图像处理软件均有相应的图像分析模块，可实现分割、单细胞追踪及定量分析等功能。

Q: 组织透明化对组织本身有化学损伤吗？会破坏组织内荧光物质（如GFP）吗？

A: 组织透明化方法分为主动式透明化方法和被动式透明化方法两个大类，以引入外力或生化试剂的被动扩散来完成对组织的透明化，组织透明化技术保留了组织的细胞间连接和细微特征。不同的组织透明化方法因其机理不同，对组织的形态、透明程度、透明效率、脂质留存、内源性荧光信号、核酸物质、免疫染色等的影响不尽相同。例如被动式透明化方法中的有机溶剂透明化方法，通过先脱去组织的水分，再利用高折射率的有机溶液进行折射率匹配，虽然达到很好的透明效果，但是对于荧光蛋白的信号产生淬灭作用。荧光蛋白中的亲水基团使得亲水溶剂透明化方法更有利于荧光的保存。被动式的亲水溶剂透明化方法通过浸泡将低折射率的组织液、细胞液或是高折射率的脂质逐渐替换，实现折射率一致，这类方法虽然更利于荧光保存，但耗时较长。基于CLARITY/SHIELD技术的主动式透明化方法从保护荧光蛋白构象出发，不仅能留存内源性蛋白、核酸，还通过电泳加速移除脂质，使透明化的效率提高。

参考文献：

冯异. 医学组织透明化三维成像 [M]. 复旦大学出版社，2020：3-21.

Chung et al., Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 2013.

Park et al., Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology, 2019. 

     直播视频回放：

https://v.qq.com/x/page/g3347h98jn8.html?sf=uri

锘海LS18平铺光片显微镜

专为透明化样品设计的高速高分辨三维荧光显微镜成像系统

针对透明化样品的3D荧光成像，采用与西湖大学高亮（平铺光片技术发明人）实验室共同研制的光片显微镜Nuohai LS 18，其运用创新的平铺光片技术，克服了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，从而获得均匀高分辨率的3D荧光图像，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学、组织病理诊断等各个领域。

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锘海组织透明化试剂盒

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锘海自主研发的组织透明化试剂盒依托测样服务中积累到的丰富而宝贵的经验，对各种透明化方法进行测试和比较后对试剂配方进行了精心优化，使其在组织荧光保护、样本形态维持、降低自发荧光等方面表现出非常优异的性能。能够轻松实现小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、睾丸、淋巴、胎盘、卵巢等各类组织器官的透明化，适用范围广、操作简便、速度快、效率高，是广大科研工作者的选择。

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锘海一站式科研服务

让科研变得更简单

组织透明化技术和光片荧光显微技术的发展，使研究者能从宏观到微观对生物组织内部的结构及生理、病理特征进行观察和功能性分析。锘海生物科学仪器（上海）有限公司提供完整器官的组织透明化、组织免疫荧光染色、高分辨3D显微成像以及大数据分析一站式服务，旨在通过准确、快速、多样化的一站式科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

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超分辨高精度显微镜3D成像模块

光学显微镜凭借其非接触、无损伤等优点，成为生物学家研究细胞功能结构、蛋白网络结构、DNA等遗传物质、细胞器以及膜结构等应用必不可少的工具，然而衍射极限的存在，使得人们无法清晰地观察到横向尺寸小于200nm、轴向尺寸小于500nm的细胞结构。二十一世纪初期，具有纳米尺度分辨率的超分辨光学显微成像技术的出现，使得研究人员可以在更高的分辨率水平进行生物研究。在超分辨显微技术飞速发展的同时，现有成像技术的缺陷也日益显现，例如成像分辨率和成像时间不可兼得；对透镜制造技术提出了一定要求的同时，也限制了观测的视野；日益复杂的设备使得操作和维护也越来越困难等。

为解决上述问题,美国Double Helix Optics公司提出了纳米级分辨率成像的新概念-“SPINDLE”，不仅突破了衍射极限，还可以实现三维成像，可捕捉到小至横向尺寸10 nm、轴向尺寸15 nm的细节。在该技术中，SPINDLE模块被安装在显微镜和ccd或相机之间，无需改变现有成像系统设置。基于特殊设计的相位掩模版，从工程化点扩散函数 (E-PSF)出发，使用螺旋相位掩模板来控制景深、发射波长和精度，结合3DTRAX软件对3D图像进行重建和分析，可在不需要扫描的条件下即时捕获 3D 信息，得到无与伦比的深度和精度3D图像，横向精度可达20nm, 轴向精度可达25nm，成像深度可达20um。当与其他工具和技术，包括STORM、PALM、SOFI、光片显微、宽场、宽场显微、TIRF、FRET等一起使用时，可释放巨大的潜力，适用于活细胞、固定细胞和全细胞成像、单分子、粒子跟踪和粒子计数等应用。

图1：SPINDLE2双通道显微镜模块，用于同时多色、多深度3D成像

SPINDLE2可以被很容易地安装到现有显微镜和CCD或相机之间，内置旁路模式可轻松返回到非3D光路，是实现单发超分辨和3D宽场成像的理想解决方案。

图2：非洲绿猴肾细胞的3D 图像，微管和肌动蛋白分别标记，两种颜色同时成像

在SPINDLE模块中，最核心的是经过特殊设计的相位掩模板，其尺寸和设计需和光学系统和成像条件相匹配。这些相位掩模板将单一物体发出的光分裂成两个独立的旋转的光瓣，类似于双螺旋。两瓣的中点对应物体发光源的横向位置，两瓣的夹角对应发光源的轴向位置。由于旋转180°时光斑可以保持聚焦，因此可以高精度地获取发光“点”的深度信息。收集的数据由许多这些在不同方向上与物体横向和轴向位置相对应的分离良好的点组成。经过对这些详细的目标点数据集处理和图像重建创建，即可得到超高分辨率原始物体清晰的三维结构。

图3：工程化相位掩模板通过每帧成像更大的体积来节省时间和存储空间，并降低感光度

丰富多样的相位掩模板库，包括双螺旋，单螺旋，EDOF，四足，和多色设计以提供大的控制和灵活性。用户可依据深度范围、波长和其他光学参数选择合适的相位掩模版以满足的深度-精度平衡。

3DTRAX® 软件用于计算每个粒子的z位置，运行专有算法以自动进行3D定位，以‹20 nm的深度和分辨率渲染高精度3D图像，用于单分子定位和跟踪。对漂移进行自动校正并生成直观的绘图，同时保持高数据质量。

图4：3DTRAX®是非常易于使用的斐济插件

使用适用于 Windows、MacOS 和 Linux 的库集成到您的工作流程或 OEM 仪器中，以 ThunderSTORM 或双螺旋文件格式保存图像并导出文件以供进一步分析，专有的反卷积算法可以在不损失精度的情况下重建全细胞图像。

图5：从左到右：非洲绿猴肾细胞的细胞骨架，小鼠胚胎成纤维细胞中的微管，小鼠胚胎成纤维细胞细胞核中的复制DNA的3D超分辨图像

超分辨显微镜3D成像模块应用

超分辨显微成像和3D粒子跟踪技术为生物学和生物医学研究、药物发现、材料科学研究和工业检测打开了一个充满可能性的新世界。双螺旋工程技术具有高达传统显微镜30倍的成像深度，其为超分辨成像带来了精度-深度平衡。在3D粒子追踪应用中，双螺旋工程带来的扩展的深度可以实现更长粒子轨迹的捕获。

在生命科学领域，双螺旋光工程正在从癌症和免疫学到传染病和神经科学的生命科学的突破。研究人员通过使用SPINDLE模块发现了新的细胞结构和亚细胞的相互作用。研究神经退行性疾病的科学家们能够看到以前从未见过的压力颗粒核3D图像。同样，研究免疫学的研究人员已经能够重建整个T细胞。

在药物开发领域，研究人员已经可以看到和跟踪药物化合物的真正工作原理，而不是简单地模拟新的化合物。双螺旋光工程实现了在成像和单粒子跟踪(SPT)领域的新突破，随着追踪分子的能力跨越更大的景深（高达20um），双螺旋可以记录比以往任何时候更长的轨迹，使得识别先导化合物和加快药物发现变得更加容易。

在材料科学领域，借助3D纳米成像和粒子跟踪技术，无论是金属、半导体、陶瓷、聚合物还是纳米材料研究，双螺旋技术都可以让您看到材料的结构、流动性等性能。精密成像与深度扩展相结合，让你对粒子动力学有了新的认识。有了更多的数据，就可以更好地预测材料在任何给定应用领域中的性能。

在工业检测领域，双螺旋工程可实现纳米尺度的三维检查。现在你可以在从微芯片到像素级的产品中发现微小的缺陷和其他功能缺陷。纳米级精度的检测，可以提高质量控制，节省时间，降低成本，提高产量和跟踪质量。

引文：[1]金录嘉, 何洋, 瞿璐茜,等. 新型超分辨显微技术的研究进展[J]. 光电产品与资讯, 2018, 9(3).

如您对SPINDLE感兴趣，请随时与我们联系！

关于昊量光电： 

昊量光电  您的光电超市！

上海昊量光电设备有限公司致力于引进国外先进性与创新性的光电技术与可靠产品！与来自美国、欧洲、日本等众多知名光电产品制造商建立了紧密的合作关系。其代理品牌均处于相关领域的发展前沿，产品包括各类激光器、光电调制器、光学测量设备、精密光学元件等，所涉足的领域涵盖了材料加工、光通讯、生物医疗、科学研究、国防及前沿的细分市场比如为量子光学、生物显微、物联传感、精密加工、先进激光制造等。

我们的技术支持团队可以为国内前沿科研与工业领域提供完整的设备安装，培训，硬件开发，软件开发，系统集成等优质服务，助力中国智造与中国创造! 为客户提供适合的产品和提供完善的服务是我们始终秉承的理念！

相关文献：

(1)Anastasiia Misiura, et. al., “Single-Molecule Dynamics Reflect IgG Conformational Changes Associated with Ion-Exchange Chromatography,” Analytical Chem., 2021

(2)Laura Hoppe Alvarez, et. al., “Controlling microgel deformation via deposition method and surface functionalization of solid supports,”

Phys. Chem. Chem. Phys., 2021,23, 4927-4934

(3)Xilin Yang, et. al., “Deep-Learning-Based Virtual Refocusing of Images Using an Engineered Point-Spread Function,” ACS Photonics, 8, 7, 2174–2182, June 2021

(4)Anish R. Roy, et. al., “Exploring cell surface-nanopillar interactions with 3D super-resolution microscopy,” BioRxiv, June 2021S. Li, J. Wu, H. Li, D. Lin, B. Yu, and J. Qu, “Rapid 3D image scanning microscopy with multi-spot excitation and double-helix point spread function detection,” Optics Express, vol. 26, no. 18, p. 23585, 2018.

您可以通过昊量光电的官方网站了解更多的产品信息，或直接来电咨询4006-888-532。

2022年4月18日，国际学术期刊Chinese Medicine在线发表了复旦大学基础医学院中西医结合学系冯异团队的研究成果“Three-dimensional visualization of electroacupuncture-induced activation of brown adipose tissue via sympathetic innervation in PCOS rats”。

多囊卵巢综合征 (PCOS) 是一种复杂且异质性的女性生殖内分泌和代谢紊乱性疾病，与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、肝损害等密切相关。在所有PCOS女性患者中，约有一半存在向心性肥胖，不孕、心血管疾病、糖尿病和非酒精性脂肪肝的发生率明显高于瘦型PCOS患者。并且PCOS对后代的新陈代谢也有显著的影响。最近的研究表明，脂肪组织包括白色脂肪组织 (WAT) 和棕色脂肪组织 (BAT) 在PCOS的发生、发展和预后中发挥着重要作用。哺乳动物WAT的功能是储存和释放能量，而BAT的功能是针对不同的刺激消耗能量和产生热量。BAT的产热活性主要依赖于位于线粒体内膜的线粒体棕色脂肪解偶联蛋1 (UCP1)的功能。临床实践中，EA已被证明可改善PCOS患者的肥胖和生殖功能障碍，在PCOS大鼠模型研究中表明EA可以影响WAT。然而，BAT在PCOS和EA治疗后的功能和神经调节仍然未知。本研究应用双氢睾酮 (DHT) 或高脂饮食，分别建立PCOS和肥胖模型，并利用透明化三维成像技术探讨BAT在PCOS大鼠模型中的作用及其与EA的关系。

该研究成果是本月继厦门大学分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室陈洪敏课题组使用锘海LS18平铺光片显微镜在Nature子刊发表 “Carbonized paramagnetic complexes of manganese (II) as contrast agents for precise magnetic resonance imaging of sub-millimeter-sized orthotopic tumors(点击链接看文章详情)” 研究成果后的另一佳作。

该文通过对大鼠脂肪样本进行免疫染色和组织透明化处理后使用了锘海LS18平铺光片显微镜进行3D成像。

原文Fig. 4A-C采用锘海LS18平铺光片显微镜对肩胛骨BAT进行3D荧光成像，结果显示肥胖和PCOS模型TH（酪氨酸氢化酶，标记交感神经）和 UCP1 （解偶联蛋白1，标记BAT活性）阳性细胞的数量减少，并且经过 EA 治疗后有所恢复（红色：UCP1;绿色：TH）。

原文Fig. 4D 三维荧光成像结果层切展示TH（绿色）和 UCP1（红色）的共定位。

锘海LS18平铺光片显微镜成像案例

原文Video S1 视频展示对照组BAT使用UCP1（红色）和TH（绿色）抗体染色后三维荧光成像结果。

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专为透明化样品设计的高速高分辨三维荧光显微镜成像系统

针对大组织样品的3D荧光成像，采用与西湖大学高亮（平铺光片技术发明人）实验室共同研制的平铺光片显微镜Nuohai LS 18，其运用创新的平铺光片技术，克服了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，从而获得均匀高分辨率的3D荧光图像，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学、组织病理诊断等各个领域。

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组织透明化技术和光片荧光显微技术的发展，使研究者能从宏观到微观对生物组织内部的结构及生理、病理特征进行观察和功能性分析。锘海生物科学仪器（上海）有限公司提供完整器官的组织透明化、组织免疫荧光染色、高分辨3D显微成像以及大数据分析一体化服务，旨在通过精准、快速、多样化的一站式科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

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《Nature》子刊：锘海LS18平铺光片显微镜和组织透明化技术助力开发新型MRI造影剂用于原位肿瘤早期诊断

锘海LS18光片显微镜助力ProTracer技术发现成体肝细胞来源-荣登Science杂志

生物组织的高分辨率3D荧光成像在亚细胞、细胞和组织水平上为基因表达、细胞形态和细胞在组织中的分布研究搭建了桥梁。组织透明化方法将生物组织透明，并结合新型的3D荧光成像技术实现了组织结构可视化。

尽管这种结合有诸多好处，但在3D组织成像应用中仍存在挑战：(1)在对厘米级样本进行微米级或更高分辨率成像时，传统光片显微镜成像效率不高；(2)传统光片显微镜难以兼容所有的组织透明化方法透明的样本；(3)不能实时校正由不同成像液的折射率变化引起的偏差，优化不同样品的成像性能；（4）显微镜仪器校准程序复杂且较为困难。

2020年11月3日，西湖大学高亮实验室团队在Cell Reports上发表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介绍了一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够对所有组织透明化方法透明的样本组织进行多色快速3D成像，并且成像的空间分辨率达微米级（4×4×10μm3）甚至亚微米级（0.3×0.3×1μm3）。另外，通过组织膨胀技术，平铺光片显微镜的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm3）。

文章指出，平铺光片技术很好地解决了上述问题。不同于其他的光片显微镜，平铺光片显微镜不仅在透明化大组织样本的3D成像上呈现更好的效果，而且可以大范围内更加简单的优化和调节成像品质，可以更方便的应用在不同领域。

那么，与其他的光片显微镜相比，平铺光片显微镜有哪些优点呢？

1） 和传统的光片显微镜相比，相同的成像时间里，采用平铺光片显微镜成像样本可提高空间分辨率以及成像效率。

2）通过变换不同NA的检测物镜，放大倍数，以及调整激发光片，平铺光片显微镜可以实现对厘米级的组织样本进行从微米级到亚微米级空间分辨率的成像，而利用组织膨胀技术可以进一步提高成像分辨率。

3）通过空间光调制器对激发光片进行相位调制，用于创建和优化样品照明的平铺光片。

4）显微镜具有半自动校准功能，保证了成像的准确性、可靠性和易用性；

5）显微镜与所有的组织透明化方法兼容，适用于不同形状，不同机械强度的组织成像。

6）不同的透明化组织样本可以在几分钟内快速更换成像；

7）可以对透明化组织进行多分辨率级别、各向同性、多色三维成像；

凭借上述优点，平铺光片显微镜对组织样本进行3D成像的结果又如何呢？

1）实现微米级空间分辨率的3D组织成像

具有近乎各向同性的微米级空间分辨率的3D组织成像非常适合在细胞水平上可视化组织结构。如图1所示，3小时内获取的小鼠脑血管网络展示了识别到的几乎所有的毛细血管。成像结果可对脑血管结构提供清晰的拓扑结构阐释。根据成像结果提取到的数据显示大脑皮层中这些穿透性的血管可通过毛细血管与位于胼胝体区域的海马内小静脉或小动脉相连接。因此，平铺光片显微镜优秀的3D成像能力可以辅助了解整脑不同脑区的血管网络分布。

图1 不同透明化方法的小鼠器官在微米级空间分辨率下的三维成像

2）多色3D组织成像能力

多色3D成像技术对研究组织内部不同细胞器的相对分布有很大帮助。平铺光片显微镜具有对所有波段的激发光进行相位调制的功能，可以确保不同激发光束共线校正，从而确保不同颜色通道采集图像的精确配准。本文通过双色标记的小鼠乳腺成像来检测显微镜的多色3D成像能力。图2（A-Y）小鼠乳腺双色成像结果表明可以清晰分辨位于乳腺管内层的腔细胞，及乳腺管外层的基底细胞。这两者的相对表达体现了乳腺导管和末端芽的不同分布模式，结果表明了乳腺细胞组成的空间异质性。

图2（Z-GG）展示了对人类的乳腺癌组织和相邻的正常乳腺组织进行成像。从实验表达结果可以看出，肿瘤组织失去了原有腺泡结构仅有异常的管状结构，并显示出具有利于癌细胞浸润的密集血管脉络系统。该患者的淋巴结肿大并伴有可疑的浸润细胞，这与脉管系统异常的表征相符。该组实验表明组织透明化和高分辨率3D组织成像技术在病理学应用中的价值。

图2 多色3D组织成像

3）亚微米级空间分辨率的3D组织成像

   为观察亚细胞组织结构，将平铺光片显微镜的检测物镜提升至1.0NA，照明物镜提升至0.28NA，产生1um薄光片对样本进行成像。如图3所示，成像结果呈现出高倍显微镜具有很好的亚细胞神经元结构的分辨能力，我们可以观察到兴奋性锥体神经元、神经元轴突上清晰可辨的树突棘和单个神经元的形态。

图3 亚微米级空间分辨率的3D组织成像

4）组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

组织膨胀技术提供了一种比显微镜更高的空间分辨率来分辨组织结构的解决方案。实验研究了平铺光片显微镜与组织膨胀技术结合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠脑透明化使用组织膨大技术将样本各向同性扩大5倍，成像空间分辨率为2um×2um×5um，那么同等的空间分辨率根据5倍膨胀比例，映射到对实际样本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像结果如图4所示，小鼠大脑海马区细胞和亚细胞神经元结构清晰可见，尽管海马区细胞密度较高，依旧可以分解出单个神经元轴突和树突棘。同时，如图4虚线框内标识可以观察到一些神经轴突的神经间的轴浆运输。

图4 组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

5) 采用组织膨胀技术实现100nm以下空间分辨率的3D组织成像

平铺光片显微镜通过采用更高NA的检测物镜和更薄的光片对膨胀组织成像，能够达到100nm以下的空间分辨率，从而实现对组织结构的进一步解析。

图5采用0.8NA的检测物镜以及更薄的激发光片展示了更精细的神经结构。研究结果表明，大脑神经网络十分复杂，纳米尺度空间分辨率的3D成像对完全解析大脑神经网络是非常必要的。

图5  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

6) 实现多分辨率尺度的三维组织成像

 平铺光片显微镜的优势是可以为其他生物组织的研究提供帮助。图6展示了平铺光片显微镜对透明化的真涡虫以从微米到亚微米多种空间分辨率成像的结果。整体成像结果展示了干细胞在真涡虫内的整体分布，局部高空间分辨率成像结果展示了真涡虫内干细胞组织以及细胞与细胞之间的相互作用关系。因此，平铺光片显微镜可以更好地研究真涡虫干细胞的分布和功能。类似的优点同样适用于其他生物研究，例如秀丽隐杆线虫，黑腹果蝇，斑马鱼等。

图6  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

结论

综上所述，本文开发了一款多功能平铺光片显微镜，具有ZY的多色3D成像能力，能够以微米级至100nm以下的空间分辨率对厘米级的透明化样本组织进行快速3D成像。该显微镜兼容所有的组织透明化方法，灵活适应不同的应用。它还具有通过相位调制实现半自动对准的能力，操作简单可靠。因此，平铺光片显微镜使得3D透明化组织成像在生物医学研究中更加可靠及可行。

上述平铺光片技术已由锘海生命科学商业化——NuohaiLS18平铺光片显微镜，同时，我们依托LS18光片显微镜搭建了锘海生命科学一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过JZ、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

原文献链接：

 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108349 

生物组织的高分辨率3D荧光成像在亚细胞、细胞和组织水平上为基因表达、细胞形态和细胞在组织中的分布研究搭建了桥梁。组织透明化方法将生物组织透明，并结合新型的3D荧光成像技术实现了组织结构可视化。

尽管这种结合有诸多好处，但在3D组织成像应用中仍存在挑战：(1)在对厘米级样本进行微米级或更高分辨率成像时，传统光片显微镜成像效率不高；(2)传统光片显微镜难以兼容所有的组织透明化方法透明的样本；(3)不能实时校正由不同成像液的折射率变化引起的偏差，优化不同样品的成像性能；（4）显微镜仪器校准程序复杂且较为困难。

2020年11月3日，西湖大学高亮实验室团队在Cell Reports上发表文章A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues，介绍了一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够对所有组织透明化方法透明的样本组织进行多色快速3D成像，并且成像的空间分辨率达微米级（4×4×10μm3）甚至亚微米级（0.3×0.3×1μm3）。另外，通过组织膨胀技术，平铺光片显微镜的分辨能力可提高至小于100nm（70×70×200 nm3）。

文章指出，平铺光片技术很好地解决了上述问题。不同于其他的光片显微镜，平铺光片显微镜不仅在透明化大组织样本的3D成像上呈现更好的效果，而且可以大范围内更加简单的优化和调节成像品质，可以更方便的应用在不同领域。

那么，与其他的光片显微镜相比，平铺光片显微镜有哪些优点呢？

1） 和传统的光片显微镜相比，相同的成像时间里，采用平铺光片显微镜成像样本可提高空间分辨率以及成像效率。

2）通过变换不同NA的检测物镜，放大倍数，以及调整激发光片，平铺光片显微镜可以实现对厘米级的组织样本进行从微米级到亚微米级空间分辨率的成像，而利用组织膨胀技术可以进一步提高成像分辨率。

3）通过空间光调制器对激发光片进行相位调制，用于创建和优化样品照明的平铺光片。

4）显微镜具有半自动校准功能，保证了成像的准确性、可靠性和易用性；

5）显微镜与所有的组织透明化方法兼容，适用于不同形状，不同机械强度的组织成像。

6）不同的透明化组织样本可以在几分钟内快速更换成像；

7）可以对透明化组织进行多分辨率级别、各向同性、多色三维成像；

凭借上述优点，平铺光片显微镜对组织样本进行3D成像的结果又如何呢？

1）实现微米级空间分辨率的3D组织成像

具有近乎各向同性的微米级空间分辨率的3D组织成像非常适合在细胞水平上可视化组织结构。如图1所示，3小时内获取的小鼠脑血管网络展示了识别到的几乎所有的毛细血管。成像结果可对脑血管结构提供清晰的拓扑结构阐释。根据成像结果提取到的数据显示大脑皮层中这些穿透性的血管可通过毛细血管与位于胼胝体区域的海马内小静脉或小动脉相连接。因此，平铺光片显微镜优秀的3D成像能力可以辅助了解整脑不同脑区的血管网络分布。

图1 不同透明化方法的小鼠器官在微米级空间分辨率下的三维成像

2）多色3D组织成像能力

多色3D成像技术对研究组织内部不同细胞器的相对分布有很大帮助。平铺光片显微镜具有对所有波段的激发光进行相位调制的功能，可以确保不同激发光束共线校正，从而确保不同颜色通道采集图像的精确配准。本文通过双色标记的小鼠乳腺成像来检测显微镜的多色3D成像能力。图2（A-Y）小鼠乳腺双色成像结果表明可以清晰分辨位于乳腺管内层的腔细胞，及乳腺管外层的基底细胞。这两者的相对表达体现了乳腺导管和末端芽的不同分布模式，结果表明了乳腺细胞组成的空间异质性。

图2（Z-GG）展示了对人类的乳腺癌组织和相邻的正常乳腺组织进行成像。从实验表达结果可以看出，肿瘤组织失去了原有腺泡结构仅有异常的管状结构，并显示出具有利于癌细胞浸润的密集血管脉络系统。该患者的淋巴结肿大并伴有可疑的浸润细胞，这与脉管系统异常的表征相符。该组实验表明组织透明化和高分辨率3D组织成像技术在病理学应用中的价值。

图2 多色3D组织成像

3）亚微米级空间分辨率的3D组织成像

   为观察亚细胞组织结构，将平铺光片显微镜的检测物镜提升至1.0NA，照明物镜提升至0.28NA，产生1um薄光片对样本进行成像。如图3所示，成像结果呈现出高倍显微镜具有很好的亚细胞神经元结构的分辨能力，我们可以观察到兴奋性锥体神经元、神经元轴突上清晰可辨的树突棘和单个神经元的形态。

图3 亚微米级空间分辨率的3D组织成像

4）组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

组织膨胀技术提供了一种比显微镜更高的空间分辨率来分辨组织结构的解决方案。实验研究了平铺光片显微镜与组织膨胀技术结合的成像能力。Thy1-eGFP小鼠脑透明化使用组织膨大技术将样本各向同性扩大5倍，成像空间分辨率为2um×2um×5um，那么同等的空间分辨率根据5倍膨胀比例，映射到对实际样本的分辨能力是0.4um×0.4um×1um。成像结果如图4所示，小鼠大脑海马区细胞和亚细胞神经元结构清晰可见，尽管海马区细胞密度较高，依旧可以分解出单个神经元轴突和树突棘。同时，如图4虚线框内标识可以观察到一些神经轴突的神经间的轴浆运输。

图4 组织膨胀的亚微米级空间分辨率的3D组织成像

5) 采用组织膨胀技术实现100nm以下空间分辨率的3D组织成像

平铺光片显微镜通过采用更高NA的检测物镜和更薄的光片对膨胀组织成像，能够达到100nm以下的空间分辨率，从而实现对组织结构的进一步解析。

图5采用0.8NA的检测物镜以及更薄的激发光片展示了更精细的神经结构。研究结果表明，大脑神经网络十分复杂，纳米尺度空间分辨率的3D成像对完全解析大脑神经网络是非常必要的。

图5  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

6) 实现多分辨率尺度的三维组织成像

 平铺光片显微镜的优势是可以为其他生物组织的研究提供帮助。图6展示了平铺光片显微镜对透明化的真涡虫以从微米到亚微米多种空间分辨率成像的结果。整体成像结果展示了干细胞在真涡虫内的整体分布，局部高空间分辨率成像结果展示了真涡虫内干细胞组织以及细胞与细胞之间的相互作用关系。因此，平铺光片显微镜可以更好地研究真涡虫干细胞的分布和功能。类似的优点同样适用于其他生物研究，例如秀丽隐杆线虫，黑腹果蝇，斑马鱼等。

图6  100nm以下空间分辨率的3D组织成像

结论

综上所述，本文开发了一款多功能平铺光片显微镜，具有ZY的多色3D成像能力，能够以微米级至100nm以下的空间分辨率对厘米级的透明化样本组织进行快速3D成像。该显微镜兼容所有的组织透明化方法，灵活适应不同的应用。它还具有通过相位调制实现半自动对准的能力，操作简单可靠。因此，平铺光片显微镜使得3D透明化组织成像在生物医学研究中更加可靠及可行。

上述平铺光片技术已由锘海生命科学商业化——NuohaiLS18平铺光片显微镜，同时，我们依托LS18光片显微镜搭建了锘海生命科学一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过JZ、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。

原文献链接：

 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108349 

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