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- af05522 2016-08-20 00:00:00
- 可用于基因工程中目的基因的获取，扩增目的基因
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- 小啦啦gg 2016-08-20 00:00:00
- PCR技术能快速特异地在体外复制目的，理论上能将其量极微的（fg DNA）目的基因在较短的时间内（1-2小时）扩增到极易检测的微克水平。PCR技术目前已经成为人们获得目标基因的Z常用的方法之一。然而其基本原理并不复杂，主要包括模板DNA（目标DNA）加热变性；降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性；72℃条件下，Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应，模板拷贝数都增加一倍，理论上n次循环后，扩增产物拷贝数为2n－1。但在PCR反应后期由于底物的消耗，Taq酶活力的下降，PCRYZ物的增加，PCR反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上30-35个循环，扩增倍数一般可达百万倍。如果想再提高扩增产物的量，可以将产物DNA再稀释1000倍作为新的模板进行第二轮的pcr扩增，一般二次扩增后的DNA数量已达到所有分子生物学操作的要求。 一、 变性，DNA双螺旋结构的生物功能在于复制与转录，加热或在碱性条件下可以使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为DNA变性。解除条件后，变形的单链DNA可以重新结合起来，再形成双链，称之为DNA复性，又叫退火。DNA双链离解一半时温度称为解链温度（Tm）。不同DNA的解链温度不同，取决于DNA中G-C与A-T的含量的区别。G-C间有三个氢键，A-T间有两个氢键，因此G-C比例大的DNA片段解链温度高，一般，G-C含量每增加1％，PCR变性温度增加0.4℃。Tm范围通常一般在85-95℃之间，PCR变性温度选择94℃，变性时间为30秒到2分钟。
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1、什么是PCR
PCR是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）的简称，其是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术。这种技术模拟体内DNA的天然复制过程，能将微量的DNA进行特异性的扩增，在短时间内获得足够的DNA，是分子生物学研究中不可缺少的一员。
2、标准PCR的过程
此项技术是模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，在整个PCR过程中包含了变性——退火（复性）——延伸三个基本反应步骤。
DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
3、为什么要使用梯度PCR仪呢
梯度PCR仪是指一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件的仪器，因为不同的DNA片段其最适退火温度不同，采用梯度PCR仪通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适退火温度，优化反应条件，进行有效的扩增。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
使用普通的PCR仪进行扩增时，只能运行一个特定的退火温度，当目的基因的退火温度不适时，就可能出现假阳性，影响实验结果。而对于梯度PCR仪，不但可以作为普通PCR仪使用，也可以通过设置不同的温度梯度（通常为12个梯度温度），研究未知DNA退火温度的扩增，有效降低或避免假阳性，同时在不理想的工作条件下扩增出产物，既节约成本也提高了实验效率。
适用于分子生物学、微生物学、遗传学、细胞生物学、食品科学和农学等领域，进行分子克隆、基因表达分析、基因型鉴定、测序、病原微生物分析等实验研究。
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- 冻干机的冻干保护剂在各个应用中有何作用？
在冻干机中，冻干保护剂作用简单来说就是为了使某些制剂能成功地进行真空冷冻干燥、改善冻干产品的溶解性和稳定性、使冻干产品有美观的形状等。需要在液体制剂中加入一些附加物质，它们就是保护剂，保护剂对冻干制品必须是化学惰性的。
下面来总结下冻干保护剂不同领域的应用作用：
1、细菌、病毒等微生物需要在特定的培养介质中生长繁殖，但是这些培养介质与微生物往往难以分离，它们能成功地冻干在这些培养介质之中。例如肉汤、脱脂乳和蛋白质等。
2、有些冻干制剂浓度很低，干物质含量极少，冻干时已经干燥的部份会被升华气流带走。为了提高浓度，增加干物质的含量，使冻干后的产品能形成较理想的团块，因此需要加入填充物质，使固体物质的浓度在4％～25％之间。这些填充物或赋形剂是蔗糖、乳糖、肌醇、脱脂乳、水解蛋白、葡聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
3、有些生物活性物质特别脆弱，在冷冻和干燥时由于物理或化学原因会受到危害，因此需要加入一些保护剂，以减少在冷冻和干燥中的损害。例如二甲亚砜、甘油、右旋糖苷、糖类和PVP等。
4、加入某些物质可以提高产品的崩解温度，使产品容易冻干。它们是甘露醇、甘氨酸、右旋糖苷、木糖醇和PVP等。
5、为了改变冻干制剂的酸碱度，从而提高共晶点，以利于冻干。它们是碳酸氢钠、氢氧化钠等。
6、为了改进产品贮存的稳定性，提高贮存温度，延长贮存时间。它们是一些抗氧化剂，例如维生素C、维生素E、氨基酸、硫代硫酸钠、硫脲、卵磷脂和水解蛋白等。
7、加入某些物质可以消除自由基团，增加冻干产品的稳定性。它们是氨基酸、维生素K、维生素C、硫脲、亚硫酸化合物、天门冬氨酸钠等。
（来源：青岛永合创信电子科技有限公司）
- 冻干机的冻干保护剂在各个应用中有何作用？
在冻干机中，冻干保护剂作用简单来说就是为了使某些制剂能成功地进行真空冷冻干燥、改善冻干产品的溶解性和稳定性、使冻干产品有美观的形状等。需要在液体制剂中加入一些附加物质，它们就是保护剂，保护剂对冻干制品必须是化学惰性的。
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3、有些生物活性物质特别脆弱，在冷冻和干燥时由于物理或化学原因会受到危害，因此需要加入一些保护剂，以减少在冷冻和干燥中的损害。例如二甲亚砜、甘油、右旋糖苷、糖类和PVP等。
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