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- George926798 2011-12-09 00:00:00
- 将正常基因导入造血干细胞或其他组织细胞，以纠正其特定的遗传性缺陷，从而达到ZL目的的方法。
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- 幻雪夜57 2011-12-09 00:00:00
- 基因ZL是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到ZL目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能ZL某种疾病。从广义说，基因ZL还可包括从DNA水平采取的ZL某些疾病的措施和新技术。 基因ZL方法 1．基因转移方法 （1）特异正常基因的分离与克隆：应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果，已有不少基因并将会有更多人类基因被分离和克隆，这是基因ZL的前提，在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有基因探针和准确的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，现在既可人工合成DNA探针，还可用DNA合成仪在体外人工合成基因，这些都是在基因ZL前，分离克隆特异基因的有利条件。 （2）外源基因的转移：基因转移是将外源基因导入细胞内，其转移方法较多，常用的要有下列几类： 1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。要达到ZL目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。 2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。 ①电穿孔法：电穿孔法是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。 ②显微注射法：显微注射是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10%。直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，目前成功使用得较多的是转基因小鼠，它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。 ③脂质体法：脂质体法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。 3）同源重组法：同源重组是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有新霉素的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡。对于体细胞基因ZL，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。 4）病毒介导基因转移：前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。 ①反转录病毒载体：反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力，可使近的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整俣的病毒可长期存留，一般无害于细胞，但也存在缺点：这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。Z严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的，所以还是可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。在反转录病毒载体中，Z常用于人类的是莫洛尼鼠白血病病毒，其人工构建的结构。 ②DNA病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体中引起插入突变，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出基因产物。有人发现，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因ZL的新方向。美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化学连接器即赖氨酸链将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与ZL基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体。采用复制缺陷的腺病毒进行基因ZL有以下优点： ①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义； ②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低； ③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达； ④已用于基因ZL的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因，而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。 2．选择靶细胞的原则 这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。 选择靶细胞的原则是： ①必须较坚固，足以耐受处理，并易于由人体分离又便于输回体内； ②具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，Z后可延续至病人的整个生命期； ③易于受外源遗传物质的转化； ④在选用反转录病毒载体时，目的基因表达Z好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关，故可用于如β地贫、严重复合免疫缺陷病等的基因ZL。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离，又可在培养中生长，并易存活，故有人用之于乙型血友病的基因ZL。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷，因此，在家族性高胆固醇血症的ZL中，有将低密度脂蛋白（LDL）受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白（minidystrophin）基因都已证明能在肌细胞中表达。 编辑本段基本程序 基因ZL (一)ZL性基因的获得 (二)基因载体的选择 (三)靶细胞的选择 (四)基因转移方法 (五)转导细胞的选择鉴定 (六)回输体内 编辑本段基本步骤 目的基因的转移 基因ZL 在基因ZL中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。
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- 论坛预告 | 2020 第三届免疫及基因ZL论坛
距离Kymriah和Yescarta获批上市已近三年。国内的细胞免疫疗法企业奋起追逐，目前已经有十多款CAR-T细胞疗法获得了临床批件，距离上市越来越近。在我们翘首以盼的同时，对免疫疗法的探索更加显得急切。新靶点的研究、实体瘤的攻克、溶瘤病毒与基因疗法的突破、自动化技术的发展以及商业化进程，太多行业人关注的问题亟待解决。ING 2020专注探讨最切实际的问题，邀请50+行业ling袖代表分享zui新的研究成果，共商免疫疗法新趋势！
论坛基本信息
名称：ING 2020 第三届免疫及基因ZL论坛
主办方：求实药社 上海求实医药咨询有限公司
时间：2020年9月4-5日
地点：上海圣诺亚皇冠假日酒店3楼亚美厅（ZG上海市普陀区金沙江路1699号）
厚泽展位：17号
论坛日程
- 怎么用基因ZL神经纤维瘤病I型（NF
- 基因ZL：创新多重技术组合，严控腺相关病毒（AAV）质量
--基因ZL与AAV--
基因ZL是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，从而达到ZL目的。所有基因疗法都利用病毒或非病毒载体将DNA或RNA输送到宿主细胞中。与非病毒载体（如阳离子脂质或化学载体）相比，病毒载体感染宿主细胞的效率更高，但同时它们可能具有免疫原性副作用。因此，在开发药物时，选择合适的病毒载体是至关重要的组成部分。
腺病毒相关病毒(Adenovirus Associated Virus，AAV)
AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染。腺相关病毒（AAV）作为一种安全有效的载体，目前已应用于多个临床试验。
临床研究项目中AAV1和AAV2约占50%
--质量控制--
--Wes全自动定量Western Blot
在AAV生产过程中，使用SDS-PAGE通过Western Blot来鉴定蛋白。然而，传统的Western Blot手动操作繁琐，重复性差，并且仅是半定量，不宜用于工业产品质量控制。
Wes全自动定量western以其独特优势逐渐替换传统western blot，可用于新型AAV衣壳的表达到下游制造全程质量控制中。
鉴定衣壳蛋白VP1/2/3
鉴定杂质
筛选抗体
检测动态范围
将市售AAV2（1x1013 GC/mL，33.8μg/mL）进行从1：8至1：256的2X倍比稀释，Wes检测VP1/VP2/VP3。
--Maurice表征AAV电荷异质性
与所有ZL药物一样，基因疗法，需要表征包装药物的递送载体电荷等。使用全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF）来表征AAV的电荷异质性，可以确保产品的稳定性和一致性。
Maurice兼具CE-SDS和iCIEF双功能。两种功能均入选国家药典。
自发荧光和紫外吸光度比较
Maurice同时兼具紫外吸光度和自发荧光检测通道。与吸收检测相比，自发荧光的灵敏度高3-5倍，可以更好检测出AAV特征性异构体峰。因而自发荧光模式更适合AAV病毒电荷表征。
Intra-assay CV
AAV2和AAV6样品一式四份进样，检测Intra-assay重现性（图2）。结果显示其高重现性：AAV2和AAV6的％RSD分别为3.95％和4.30％（表1）。
Inter-assay CV
AAV6样品三次独立实验，每次实验三次重复，来检测Inter-assay重现性（图3）。％RSD为6.6％（表2）。
变性AAV蛋白电荷表征
致载体活性，衣壳装配和转导效率降低1。icIEF方法通常用于监测由唾液酸化，糖基化和脱酰胺作用诱导的单克隆抗体的电荷异质性，因此对AAV病毒蛋白也进行类似的评估。使用一式三份电泳图叠加使用吸光度和自发荧光检测法进行评估，AAV2电荷变异体可以清晰分辨和重现（图4）。
灵敏度及线性
将变性的AAV2从〜3 x 1012 GC/mL连续滴定至〜3 x 1011 GC/mL（图6）以建立方法的灵敏度。该滴定范围内观察到很强的线性相关性，R2为0.9956。
监测AAV颗粒稳定性
对完整的AAV样品进行温度压力测试，以确定是否可以使用Maurice监测病毒载体的稳定性或衣壳蛋白脱酰胺。
AAV6颗粒非常稳定，在37°C或50°C下保持10分钟完整无缺。但是，当AAV6颗粒在60°C下10分钟时，不稳定。
监控AAV批间差
利用Maurice icIEF天然荧光监测批次间变异，以鉴别病毒载体批间差别。五批不同的AAV6，每批具有不同的基因组含量/mL（GC/mL），Maurice icIEF自发荧光分析（图9）。结果显示，所有五个批次在pI〜9.25左右均产生相似的峰形。但是，在一批中观察到了一个较低pI的附加峰，表明该样品与其他四批样品不同。
主要参考资料
1. Deamidation of amino acids on the surface of adeno-associated virus capsids leads to charge heterogeneity and altered vector function, AR Giles, JJ Sims, KB Turner, L Govindasamy, MR Alvira, M Lock, JM Wilson, Mol Ther, 2018; 26(12):2848-2862.
2.Dan Wang, Phillip W. L. Tai and Guangping Gao，Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery，Nature Reviews Drug Discovery，2019
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死亡之舞
亨廷顿舞蹈症（Huntington’ s disease, HD），又名慢性进行性舞蹈症，是一种缓慢起病的遗传性神经退化疾病。
亨廷顿舞蹈症表现为短暂不能控制的装鬼脸、点头、手指跳动。随病情加重，不随意运动恶化，出现舞蹈样不自主运动、吞咽困难等症状。亨廷顿舞蹈症通常在发病 15～20 年后死亡，对亨廷顿舞蹈病的ZL目前于针对症状的ZL，没有方法可以预防发病或减缓进展，因此国内外医学界称之为“死亡之舞”。
图片来源：https://trypanophobia.wordpress.com/2012/10/30/darker-dancing/
停止死亡之舞！
亨廷顿舞蹈症由常染色体显性突变引起，在亨廷顿基因（HTT）的diyi个外显子中存在CAG三核苷酸的异常重复扩增，大脑中不断聚集突变蛋白（mHTT），Z终导致神经功能失调和退化。
通过基因ZL，靶向YZ突变CAG重复序列，YZmHTT表达，或可成为亨廷顿舞蹈症ZL的关键。
“纳米级手术刀”扭转局面
2019年6月， Nature Medicine 发文报道，通过对转基因tgHD小鼠的研究发现，重组AAV将ZFP-TFs递送给原代神经元，可实现突变mHTT mRNA和mHTT蛋白降低98%以上，但对正常HTT表达没有影响。通过脑脊液中mHTT蛋白检测发现，mHTT蛋白呈现剂量依赖性减少，一次注射就可以使mHTT在相当长一段时间内稳定。
2020年2月，Nature Communications 在线发文，通过重组AAV将AAV-GFAP-Cre、AAV-DIO-NeuroD1和AAV-DIO-Dlx2混合注射在纹状体中，可将纹状体星形胶质细胞成功转化为神经元。
近期，uniQure公司宣布其基于AAV5的候选基因疗法AMT-130用于ZL亨廷顿病已获得FDA研究性新药（IND）批准，允许开始其I/II期临床研究。
不治之症或将在基因ZL手中，扭转局面。
mHTT蛋白成为亨廷顿舞蹈症研究的Z佳生物标志物之一
对亨廷顿舞蹈症患者脑脊液中疾病相关蛋白进行定量分析，有助于监测疾病进展和评估ZL干预的效果。伴随着疾病的进展，患者脑脊液中的mHTT浓度增加；ZL后mHTT蛋白浓度呈剂量性下降。mHTT蛋白成为亨廷顿舞蹈症研究的Z佳生物标志物之一。
病程Z早期mHTT蛋白在脑脊液中浓度非常低，通常低至fg/ml级别，常规Elisa等蛋白检测方法无法检出这些蛋白。ZL晚期检测中，同样也会出现这一问题。因此，在病程监控和治LX果评价中，通过超高灵敏度的蛋白检测方法实现fg/ml低丰度表达蛋白的定量显得尤为重要。
图：SMC™超敏技术对不同年龄tgHD小型猪脑脊液中mHTT蛋白进行检测，年龄与mHTT水平呈正相关（Molecular Therapy，2018）
默克SMC™超敏检测实现mHTT蛋白飞克级定量
默克SMC™ 单分子免疫检测平台，可实现10 μL脑脊液中mHTT蛋白fg/ml准确定量。针对mHTT-Q45(1-573)定制开发的SMC™试剂盒Z低检测下限LOD可达0.043 pg/mL （数据来自默克R&D实验室），满足样本中mHTT基线的全部检出。
图2：SMC™独特的检测洗脱步骤和ZL的激光单分子计数技术，有效降低背景信号值，增强检测信号，实现飞克级蛋白定量
经验分享：默克SMC™ mHTT超敏试剂盒开发经验分享
试剂盒的开发往往需要不断的尝试与经验积累。如何开发属于自己的SMC™超敏试剂盒，提升自有抗体对的检测灵敏度 ？在开发SMC™超敏试剂盒的过程中，需要注意哪些事项 ？ 默克CAST（customer assay R&D）团队主管Sarah将与您分享相关话题。Sarah拥有30多年的Bio-pharm研发经验和丰富的SMC™超敏试剂盒开发经验。
Sarah将与大家分享如下话题：
SMC™单分子免疫检测技术实现HTT痕量检测的原理
如何达到mHTT 和总HTT蛋白的fg/ml级定量
SMC™超高灵敏度试剂盒的开发与验证
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- 在人工合成基因的方法中，通过以目的基因转录的信使RNA为模板来反转录成的互补的单链DNA 只是由原基因的编码区对得内含子的剪切与对外显子的拼接完成的 在抗虫棉实验中将这一目的基因导入棉的受体细胞后 检测到了抗虫基因 但此基因不能在高等植物中表达 后来... 在人工合成基因的方法中，通过以目的基因转录的信使RNA为模板来反转录成的互补的单链DNA 只是由原基因的编码区对得内含子的剪切与对外显子的拼接完成的 在抗虫棉实验中将这一目的基因导入棉的受体细胞后 检测到了抗虫基因 但此基因不能在高等植物中表达 后来将此基因修饰后才表达的 那么修改的是这一基因的哪一区域？是非编码区么？开始的目的基因不是只有外显子部分么？又是如何修改的使基因能表达且反复表达的呢？【以转基因抗虫棉为例即可】 谢谢 展开
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