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  王建顺happy 2018-02-20 21:55:04

  有限稀释法是一种常用的克隆方法。 将需要再克隆的细胞株自培养孔内吸出并作细胞计数，计出1mL的细胞数。 用HT培养液稀释， 使细胞浓度为50～60个/mL，于96孔培养板中每孔加0.1mL(五六个细胞/孔)。 接种2排，剩余细胞悬液用HT培养液作倍比稀释，再接种2排，如此类推，直至使每孔含0.5～1个细胞。 培养7～10d后，选择单个克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此重复3～5次，直至达100％阳性孔率时即可，以确保抗体由单个克隆所产生。 例如： 实验细胞克隆化培养技术—有限稀释法 一、实验目的： 1、掌握用有限稀释法进行细胞克隆化培养技术； 2、学会细胞克隆形成的辩观察技能； 3、配合抗体分泌细胞筛选技术，确定抗体分泌细胞。 二、实验原理： 克隆化培养即单细胞培养技术，用有限稀释法进行杂交瘤细胞克隆化培养，可以及时确定阳性杂交瘤细胞株，同时淘汰因发生染色体丢失或抗体的轻、重链基因分离而出现无抗体分泌阴性细胞株。 一般杂交瘤细胞需经过52—3次反复克隆后，才能达到细胞阳性率。 该办法亦适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择，识别和分离。是细胞株的常用方法。 三、实验材料： 杂交瘤细胞、25毫升培养瓶、96孔细胞培养板（天津有机玻璃厂）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、弯头滴管、倒置显微镜、CO2培养箱、白细胞计数板、计数器、盖玻片、防水笔、RPMI-1640、小牛血清、青链霉素、10毫升刻度离心管，00橡胶塞，饲养细胞（3-6×105/ml、见腹腔细胞的制备）。 四、实验步骤： 1、分装了每孔0.1毫升腹腔细胞的96孔细胞培养板（可提前24小时准备就绪，置CO2培养箱中备用）； 2、自细胞培养瓶中收集长势良好的杂交瘤细胞（亦可自24孔培养板孔中收集），制成悬液。 3、按白细胞计数方法准确计得细胞悬液的细胞数，一般在105/毫升左右。 4、取3支10毫升刻度离心管排列在超净工作台试管架上，先用无血清培养基将细胞稀释至103/毫升，再用含15%小牛血清的完全培养基稀释到101/毫升细胞，即每0.1毫升1个细胞。 5、每孔0.1毫升细胞悬液。 6、置37℃5%CO2培养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记，做好记录并统计结果。 7、继续培养时，则在第4-5天更换1/2培养基，约第7-9天可以收获培养液上清用于检测抗体。并重复检测1-2次。 8、选择单克隆生长孔，生长良好，阳性强者，转移到24孔板再做克隆经培养或扩大培养。 五、实验结果： 实验结果以总细胞孔（如96孔）中出现克隆孔统计出克隆百分率，并可进一步按单细胞孔、双细胞孔、多细胞孔分别计算出百分率。 六、注意事项： 1、注意无菌操作，一旦发现污染（孔）必须及时处理； 2、计数细胞要求准确，稀释量亦要准确，否则将造成一孔多细胞克隆或克隆百分离太低； 3、在计数克隆出现率之前，不宜更换培养液，也不宜强烈振动培养板； 4、做克隆化培养的小牛血清必须是优质血清； 5、若做克隆抗体检测时，特别要保护细胞的生长状况，防止细胞生长不良甚至丢失。 七、说明： 哺乳动物细胞通过分离、稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液中，形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活曲线，即在接种相同数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线，观察其对细胞的听见害程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突变细胞。

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