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今天我们来聊聊色谱温度

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温度是影响气相色谱分离度的重要参数之一，详细讲解之前，先来看一下分离度方程：

左边的Rs代表分离度，右边的N代表柱效，α代表选择性，K代表选择因子。

保留因子

对于化合物保留，一般来说，温度降低，保留增强，温度升高，保留变弱。

柱温每上升30度，保留时间降低50％。

选择性

对于选择性α，降低温度，可以优化分离度。

柱效

另外，温度还在一定程度上影响到柱效，温度升高时，出峰变快，峰展宽变小，柱效也就升高。

气相色谱方法又分为恒温方法和程序升温方法。

恒温方法

在恒温方法中，色谱柱的温度保持不变。它对于沸点差异不大，保留性质差不多的化合物组比较有效。

但是，当要分析的物质保留性质差异较大时，较晚出的色谱峰就会出现峰展宽、峰型变差、灵敏度降低等各种问题。

而较早出的色谱峰又很难达到满意的分离度，这时候我们就需要用程序升温方法了。

程序升温法

在程序升温的方法中，柱温起始温度较低，让较早出的色谱峰实现比较好的分离。

接下来温度上升，并在较高温度下保持一段时间，可以让后出的色谱峰整体前移，缩短分析时间。

这样保留较强的化合物出峰提前，实现更窄的峰宽和更高的灵敏度。

如何设置和优化程序升温条件

一般采用上面这个标准的测试升温梯度，做为条件优化的起始：测试升温梯度

1、初始温度尽量低，比实验室室温高15度就可以了。

2、然后，以每分钟10度的速度升温。

3、Z后在色谱柱Z高耐受温度以下20度左右停留10分钟，观察所有进样的化合物都能够以不错的分离度全部跑出色谱柱。

4、然后根据得到的色谱图对条件进行进一步的优化。

升温方法选择

如果所有峰出峰时间的“窗口”小于程序升温时间1/4，那这个方法就可能考虑采用恒温方法。

建议恒温温度比Z后一个峰的出峰温度低45度，接下来可以以10度左右上下调整，以得到Z满意的分离度。

如果所有峰出峰时间的“窗口”大于程序升温时间1/4，或者恒温分析无法获得满意的分离度，那就需要采用程序升温的方法。

初始温度设定

对于不分流进样来说，初始柱温通常设定的比溶剂沸点低10到20度，保持1分钟。

因为在不分流模式下，衬管中的气体流速很小，样品需要较长的时间才能跑到色谱柱里，因此，需要使用较低的初始柱温，利用溶剂聚焦来获取更窄的峰宽。

对于分流进样，衬管里的载气流速很快，样品几秒钟内就会从衬管转移到色谱柱。所以从样品聚焦的角度，对初始温度没有特别的要求。

有时候可以稍微降低初始温度和延长保持时间，来改善靠前出的峰的分离度。

升温速率设定

其次，是升温速率的设定，它对靠中间出的峰的分离度有巨大的影响。

一般来说，升温速率越快，出峰越快，分析时间越短，但是会降低峰的分离度。

所以这是一个效率和效果的博弈，我们期望用Z短的分析时间，达到满意的分离度。

一般来说，推荐的升温速率可以用这个公式来计算：

这里的T0为死时间，就是不保留的化合物在色谱柱上的出峰时间。

恒温平台设定

如果用同一个升温速率，中间有些峰仍然无法实现很好分离的话，可以在这些峰出峰温度以下45度左右设置一个恒温平台，保持2到5分钟后继续升温，这样能够实现更好的分离。

对于复杂的样品，可能需要设置多个升温的平台，才能实现Z优化的分离。

结束温度设定

Z后是结束温度的设定。升温Z高的温度一般设置为Z后一个色谱峰出峰温度以上20度左右。

但是对于有些复杂基质的化合物分析，我们会把程序升温的结束温度设定的更高一些，对色谱柱进行一段时间的烘烤，防止有些高沸点的化合物在色谱柱中残留，影响后续的检测。

但是要注意不能超过色谱柱的Z高耐受温度哦。

现在你知道程序升温应该怎么科学地设定了吧，还不快去气相上试试看!大家有什么问题，也请给我们留言哦~

*授权转载自色谱学堂，禁止二次转载

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因薄层棒用氢火焰扫描的线性关系与样品的性质有关，所以每种新样在定量分析之前，蕞好用实际样品测定线性，如果线性太大或太小，应调整操作条件（扫描速度和氢气流量）使线性适中。另外，除了个别情况下组分的性质相近其面积百分数与组分含量相近外，在运用棒状薄层色谱氢焰的扫描法时，必须实测校正因子。由于校正因子与实验条件有关，所以当实验条件改变或SY一批新棒时也必须重新校正。

关于润扬棒状薄层色谱仪

棒状薄层色谱仪是采用棒状薄层分离技术与氢火焰离子化检测 (TLC/FID) 手段组合而成的专用分析仪器，可检测所有的有机化合物，特别适用于重油类分析，示踪有机合成反应过程。RY-CF19是在吸收国内外薄层色谱基础上经过多年的不断完善和发展新近推出的一款可替代进口的棒状薄层色谱仪，可在开放的气氛下检测用气相色谱和液相色谱方法很难检测的样品，并可以非常简单的对于点在色谱棒上的样品进行定量分析。

RY-CF19棒状薄层色谱仪采用了新型的电子传感流量控制技术和高精度的激光精密加工工艺，无论是实验分析方法还是整体仪器质量都非常可靠，从而保证了实验分析数据的准确性和可操作性，尤其对重质油品及大分子族组成定量分析是行之有效的手段。广泛用于石油化工、石油地质、煤炭化学、精细化工、医药卫生及环境化学等方面，具有操作简单、分析速度快、分析周期短、环保等特点。仪器采用LED大屏显示，内容丰富；中文触键操作，得心应手；全自动智能软件运行控制，自动控制再现性好，机械性能稳定可靠。

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多重分析，即在单个反应中检测多个靶标，可以帮助用户节省宝贵的样品，并节省时间、试剂和成本。此外，和做多次单重实验相比，由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测，使得样品和试剂的移液操作误差减少，因此多重检测可以提高定量精度。naica®微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和JZ。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测，从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件，可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。

评估引物和探针性能的实验指南

1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix，该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica®微滴芯片数字PCR系统的实验数据。

2.单重反应测试。在进行多重反应之前，每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如，对于三重分析，在多重反应混合进行之前，首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时，预期结果只出现单一阳性。

3.为了优化多重分析性能，样品性质也是十分重要的因素(例如，游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段，分析游离DNA需要设计成短片段DNA，分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。

4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的YZ剂。如果样品材料稀少或不容易获得，可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。

5. 评估每个单重反应的退火温度范围，在ZJ反应温度下，阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准，用于确定所有探针的ZJ退火温度。如果单重反应没有被很好地优化，可能会出现明显的非特异性扩增。此外，非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下，可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增，如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。

▲图1 ：Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图，在60°C到65°C退火温度内， 蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的ZJ退火温度。可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的ZJ退火温度。(带*数字为可分性评分)

▲图2 ：可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是

由Crystal Miner软件自动计算，并可以在高级QC标签栏下找到。

6.在选定的退火温度下，使用所有引物和探针进行多重naica®微滴芯片数字PCR系统，并以区分度为指导，评估反应性能。如果有需要，可从以下几点优化:

★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始，并增加循环数，以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。

★ 调整引物和探针浓度——naica®微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。

▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)

浓度不断增加时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分，

及在低引物探针浓度的选择标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)

★ 使用修饰的碱基，如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB)，以提高探针的Tm值，同时保持较短的长度(可能<20nt)。然而，在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个，以避免扩增减少。

7.评价引物和探针的相互作用：在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在ZD。二聚体是可以评估的，相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此，多重分析时，建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加浓度至1 uM(例如，提高扩增效率)。

▲图4：引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，红框)。当使用反向引物RI target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。当使用正向引物F1 target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，FI target 2应被选择用于多重检测。

8.对于多重分析，荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照，Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。

naica®微滴芯片数字PCR系统

naica®微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行JD定量。2.5小时内，可快速获得结果。