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4.5.2 冻干产品的质量及其变化

假设冻干本身是在最优条件下进行的，而且在冻干过程结束时产品达到了预期的质量，冻干产品在存储过程，其质量变化至少受三个因素的影响：残余水分，存储温度及混合在包装袋里的气体。与其中一种因素有关的或在更多情况下与三种因素都有关的变化可分成以下四种情况：

①在与水分子的重组过程发生的变化和/或溶解性；

②干燥产品的化学反应；

③产品生物-医学活性的恶化；

④产品物理结构的变化，例如：由非晶形转变为部分或全部晶体结构的形式。

通常发生的变化可由这几种变化中的某几种解释。下面给出了几个典型例子。

Liu和Langer证明BSA，卵清蛋白、葡萄糖、氧化酶和β—乳球蛋白在37℃时溶解性迅速减小，并且如果在已干产品中加入了30%（质量分数）生理盐水缓冲液，则在24h内97%的产品将变为非溶解性的。由于水分而引起的聚集归因于分子间的S一S键。对于给定的白蛋白，如果RM为最优值则可减少聚集。

Zhang等人研究了在keratonocyte增长因子(KGF)重组过程重组介质对形成聚集的影响。若干添加剂可使聚集明显地减小，调节重组介质离子的强度发现也有类似的作用。优化重组条件可增加蛋白质可溶性的恢复；对于KGF，蛋白质溶解性的恢复与本身的、单节显性的组成有关。此外，Zhang等人还发现当用纯水重组时，白细胞素-2(Ⅰ)和核糖核酸酶（Ⅱ）在+45℃的温度下存储时聚集相当大。如果在重组水中加入肝磷脂或磷酸盐可明显减少聚集的长度。Shalaev等人研究了在RM<0.1%时，非晶形蔗糖对葡萄糖和果糖酸性催化转化作用。即使RH=0.1%，在50℃冻干蔗糖时，例如带有柠檬酸，也得经受酸催化转化，作者得出的结论是冻干带有蔗糖的酸性物质即使是RM很低也会产生能够进一步和其他成分起反应的物质。

Yoshika等人利用ONMR光错学研究了在存储过程中β-牛乳糖间的反应和水的迁移率有关。水分的增加也使自旋-晶格弛缓时间T₁增加，相互之间的反应与T₁的关系比pH值的关系还要紧密。设想可能是水的增加使酶周围的水的迁移增加，从而使酶的反应增加。带有少量水的冻干样品，也表现出比根据pH值和水的迁移率估计的还要快的反应速度，这可能是由冻干时所用的添加剂盐引起的。Yoshika等人也使用了NMR光谱学，但用的是¹H自旋-自旋独缓时间T₂。测得BSA和γ-血球素的T₂是随水合程度而变化的。冻干的BSA和BGG如果水分超过大约0.2%(g/g)蛋白质，则对聚集变得敏感。蛋白质质子的T₂在水分较低时就开始增加，且随水分的增加聚集也紧跟着增加。对于冻干的BGG，在水分>0.5g/g蛋白质时蛋白质质子的聚集和T₂都将减小。

Vromans和Schalks利用非晶形维库溴铵研究了水敏性药品的稳定性。在制剂中其分解主要取决于水的活度αW，而不是水分的多少。赋形剂的玻璃化不仅有低温保护作用，而且起稳定作用。Cleland等人发现当蔗糖和蛋白质具有适当的分子比率时，在40℃可稳定保存人类单克隆抗体重组细胞(ruhMAb HER2)33个月。360：1的摩尔比率可成功地稳定蛋白质。这比通常的制剂中所用的等渗浓度低3～4倍。Souillac等人比较了冻干和物理混合的h-Dnase、rh-GH和rH-IGF-1和甘露醇、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷的焓。对物理混合物，发现焓与蛋白质的百分含量呈线性关系；对冻干的混合物此关系是非线性的。作者得出的结论是在冻干的混合物中蛋白质和碳水混合物之间会直接发生反应。

Hsu等人发现已包装的产品也有可能发生分解。设想冻干结束时只具有单分子层的水，且不是均匀分布的，但是在有些位置分子可能连成串。在干燥和存储过程这些水提供的保护以防止变性。这点是由基因技术产生的两种产品证明的：太少的水，比单分子层还少，造成tPA和高铁血红蛋白在物理上的不稳定，然而较高含量的水却导致存储过程生物上的不稳定。

To和Flink以及van Scoik和Carstensen阐述了四种变化的例子：依To和FIink的观点，非晶形到晶体的转变或者是因为存储温度T(T>TC)太高，或者是因为吸收了水。（注：较多的水增加了非晶形固体的流动性，促进了晶体的成核和增长）。

Van Scoik和Carstensen交流了他们关于蔗糖晶体成核和增长的经验。讨论了温度和残余水分这两个成核参数，建议用添加剂可停止、延缓或加速成核。用来清洗装有小瓶的干燥室的气体和加入产品的包装袋里的气体的影响尚且不清楚。只是氧气在多数情况下被排除。Spiess建议用干空气存储花椰菜和蓝莓，然而胡萝卜和辣椒粉应该存储在氧气含量<0.1mgO₂/g干物质的气体中。对于药品，病毒或细菌，无法给出普遍的建议，由于CPA、添加剂的结构、缓冲剂的影响都应考虑。

所有气体的纯度也应该做详细说明，由于一定量的杂质对存储特性有可能起决定性的作用，例如从瓶塞中解吸出的气体。Greiff和Rightsel证明流行性感冒病毒在没有CPA的情况下当RM为1.6%时在氨中的传染性保持得非常好。如果使用通常的存储温度，在氩中，传染性减小大约10倍，在氧气中减小20多倍。Corveleyn和Remon冻干了两种不同的包含25mg二氢氯噻的药片制剂。药品用PVC/铝塑包装、聚偏二氯乙烯(PVDC)/铝塑包装、带干燥剂的密闭容器和非密闭容器在60℃以三种RH，45、60和85%存储。一个月后，除了包装在PVDC/铝塑包装中的药片以外，其余药RM都由2.7%增加到6.8%。水分为7.2%的制剂崩塌。PVDC/铝塑包装中药片的水分的增加或减少非常慢。用于包装冻干药片的材料没有一种能阻止水分的吸收和结构的崩塌。

4.2.4 热力学分析

Carrington等人利用热力学分析(TMA)研究了30%质量分数果糖、蔗糖和葡萄糖在有和没有羧甲基纤维素钠(CMC)存在时冰的结晶温度。TMA被用来测量冷冻和复温过程样品的膨胀，利用DSC也做了类似的研究。用TMA测得果糖在有和没有CMC存在，以5℃/min的速率冷冻时的具有代表性的结果如图4-39所示。图4-40表示的是由TMA确定的30%蔗糖溶液慢速冷冻和热处理后的加热曲线。图4-41表示的是由DSC确定的30%蔗糖溶液慢速冷冻和热处理后的加热曲线。比较由两种方法测得的关于蔗糖的两个温度Tr1和Tr2(如图4-40和图4-41所示)，Tr1≈-60℃(TMA)和-41.2℃(DSC),Tr2≈-35℃(TMA)和-32.6℃(DSC),很明显，正如作者所讨论的那样，有很多因素影响最后所得的数据。

TMA测量对解释在加热冷冻的甘露醇和其他立体异构体溶液过程中，小玻璃瓶的破裂是很有用的。例如，甘露醇在-25℃以上体积比标准1型无色玻璃扩大30倍。小玻璃瓶是否破坏主要取决于填充物的体积及浓度，例如，当装满3%的甘露醇时，10%-40%的玻璃瓶子被破坏。

4.2.5 介电分析

Pearson Smith通过三个例子解释了介电分析（DEA）的优点是可提供最优的冻干工艺。结合水（两个氢键）和吸附水（一个氢健）的弛豫特性不同可用来确定冻干的结束，当吸附水解吸和结合水仍然存在时认为冻干结束。物质的介质响应与晶体的尺寸和水合程度有关。赋形剂的玻璃体形成特性和它的分子的流动性（黏性）与温度和水合密切相关。电介质的研究表明了糖溶液玻璃体形成的非阿伦尼乌斯(non-Arrhennius)行为，在温度或水合有微小变化时，黏性的变化将达好几个数量级。

Morris等人建议利用介电分析法可预测双组分物质的崩塌温度。DEA的基本情况已解释清楚了。“发射颜率”(TOF)是确定崩塌温度的分析方法。图4-42表示介质损耗因子与频率之间的函数关系曲线。作者称此曲线最低点的频率为TOF。如图4-43所示TOF随着温度的变化而变化。两直线的交叉点可确定崩塌温度。用TOF预测的10%的蔗糖、10%海藻糖、10%山梨糖醇以及11%的

Azactam TM溶液的崩塌温度稍低于冻干显微镜观察得的崩塌温度，偏差分别为-3℃，-1.4℃，2.2℃和0.7℃。

Smith等人认为介电弛缓频谱学提供了一种研究聚合物和蛋白质结构特性的方法，其中，还提供了含水量和水的状态信息。

4.2.6 X射线衍射学-拉曼光谱学            

Cavatur和Suryanarayanant研制了一种低温X射线粉末衍射(XRD)技术，用于研究冻结水溶液中溶质的固体状态。在冻结的乙氧萘青霉素钠溶液（质量分数22%）中，未发现共晶结晶。在-4℃热处理可引起溶液的结晶，且随热处理时间而增加，另外两种产品的研究表明，XRD在不干涉其他事件的情况下，可提供结晶程度的信息。

Sane等人利用拉曼光谱学用数量表示了冷冻干燥和喷射干燥过程结构的变化。单克隆抗体类（例如RhuMAbVEGF)在没有低温保护剂的情况下，经历二次结构变化。增加低温保护剂的摩尔比率可完全保护其结构。利用拉曼光谱学观察到干燥蛋白质的长期稳定性是与结构变化相关的。