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　　µ-Slide 8 Wellhigh（货号：80806）8孔高壁进行免疫荧光染色

　　免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。

　　下面我们将介绍一种在ibidi µ-Slide 8 Well high 八孔高壁载玻片中培养和免疫荧光染色的贴壁人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的一体化简单便捷的方法：

　　请注意：在开始细胞免疫荧光实验之前，需要检查几个重要参数，例如目标蛋白质的表达水平、最佳细胞密度以及理想的培养细胞的耗材和基质/涂层。还应评估最佳抗体稀释度。此外，阳性和阴性对照是验证免疫荧光染色的必要条件。因此，我们强烈建议在实验前进行全面的文献研究。

　　1. 材料

　　1.1. 试剂和缓冲液：

　　• 人脐静脉内皮细胞（HUVEC、C-12203、Promocell）

　　• 胶原蛋白 IV（354233，Corning）

　　• 0.05M HCl (X942.1, Carl Roth)

　　• 细胞培养基：内皮细胞基础培养基（C-22210，Promocell）和内皮细胞生长培养基补充混合物（C-39215，Promocell）

　　• PBS（14190144，Gibco）

　　• Accutase（A1110501，Gibco）

　　免疫荧光染色：

　　•  PBS（14190144，Gibco）

　　• 福尔 马林，10%，即用型（HT5011，Sigma Aldrich）

　　• 单克隆抗 α-微管蛋白（T5168，Sigma Aldrich）

　　• 抗小鼠 IgG-Atto 594 (76085 Sigma Aldrich)

　　• 鬼笔环肽 488 偶联物（ab176753，Abcam）

　　• 使用DAPI 的ibidi 抗荧光淬灭剂（50011，ibidi）

　　• Triton-X-100（A16046，Thermo Fisher Scientific）

　　• 穿透缓冲液（PBS 中0.5% Triton-X-100）

　　• 封闭缓冲液（PBS 中1% BSA + 0.2% Triton X 100）

　　• 抗体稀释缓冲液（1% BSA + 0.05% Triton X 100 的PBS 溶液）

　　• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

　　• ibidi浸油（50101，ibidi）

　　1.2. 设备：

80806八孔高壁

µ-载玻片架（80003）

　　• µ-Slide 8 Well high 8孔高壁腔室载玻片，ibiTreat（80806，ibidi）

　　• µ-载玻片架（80003，ibidi）

　　• 标准细胞培养设备（移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数器等）

　　• 带有适当滤光片组的倒置荧光显微镜

　　2. 方法

　　2.1. 细胞培养：

　　使用前µ-Slide 8孔高壁腔室载玻片前，请阅读说明书。在无菌条件下执行所有步骤。实验开始前，在标准细胞培养瓶中制备 HUVEC(如T75，用0.05 M HCl包被6.7µg/ml IV胶原蛋白1 小时)，细胞贴壁。实验当天细胞应该是健康的并且处于最佳汇合状态。

　　在整个过程中快速工作很重要，这样孔中才不会干涸。

　　如果未另行说明，则所有给定的体积都为每孔的体积，所有的孵育步骤都是在室温下进行的。

　　• 用Accutase处理培养的HUVEC 1-2分钟以进行分离。

　　• 收集细胞悬液，离心，用少量培养基稀释后进行计数；量取决于所需的细胞浓度。

　　• 计数细胞，在内皮细胞基础培养基和内皮细胞生长培养基补充混合物中，并调整到最终浓度为 2 x 105cells/ml 。

　　• 打开 ibidi µ-Slide 8 Well高壁的包装并将其放在µ- Slide Rack或适当的表面上。

　　• 在每个孔中加入250µl的HUVEC悬浮液。

　　• 盖上随附的盖子。

　　• 将载玻片与支架一起放入培养箱（37°C，5% CO2）中，让细胞附着至少3小时或过夜。

　　• 对于延长细胞培养，我们建议每隔一天更换一次培养基。

　　2.2. 固定、透化和封闭：

　　• 为您的实验准备足够的穿透缓冲液和封闭缓冲液。

　　• 使用细胞培养吸液装置从孔中吸出细胞培养基。

　　• 用PBS清洗细胞：将200 µl PBS缓慢加入每个孔中并吸出。

　　• 用200µl福尔 马林 (10%) 固定细胞10分钟。

　　• 去除福尔 马林并用200µl PBS洗涤细胞3次。

　　• 将细胞在200µl穿透缓冲液中孵育10分钟。

　　• 去除穿透缓冲液并用200μL PBS清洗细胞。

　　• 用200µl封闭缓冲液封闭30分钟。

　　2.3.染色和封片：

　　• 在封闭步骤中，准备足够的抗体稀释缓冲液来稀释一抗和二抗。

　　• 在抗体稀释缓冲液中稀释一抗（α-微管蛋白：1:200稀释）。

　　• 将细胞在150µl一抗溶液中孵育 2 小时（请注意，许多抗体需要在4°C下过夜孵育）。

　　• 用200µl Blocking Buffer清洗两次。

　　• 在相同的抗体稀释缓冲液中稀释二抗和鬼笔环肽（anti-mouse-IgGAtto 594：1:200 稀释度；鬼笔环肽488偶联物1:1000 稀释度）。

　　• 在黑暗中将细胞在150 µl的二抗溶液中孵育 2 小时。从此时起，样品应尽可能保存在黑暗中

　　• 用200 µl Blocking Buffer清洗两次

　　• 清空所有孔。

　　• 每孔加入一滴含有DAPI的ibidi封固剂。

　　• 储存在4°C的黑暗中，直到成像，建议立即进行成像，因为较长的存储期可能会降低图像质量。

　　2.4.成像：

　　• 使用适当的滤光片组在荧光显微镜下观察细胞，必要时使用ibidi 浸油。

　　• 可选，覆盖图像以创建合并图像。

　　3. 结果

　　HUVEC 在µ-Slide 8孔高壁腔室载玻片中免疫染色 ，宽视场荧光显微镜。F-肌动蛋白细胞骨架被鬼笔环肽（红色）染色。α-微管蛋白抗体用于染色微管（绿色）。用 DAPI（蓝色）可视化细胞核。该图像是在尼康显微镜上使用具有油浸的 60 倍物镜拍摄的。

　　如果您的免疫荧光(IF)染色未达到预期效果，您可以在这里（免疫荧光染色故障排除指南）里找到故障排除提示！