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在任何药物研发进程中，实验方法的设计和优化对新药研发的成功性而言至关重要。我们需要考虑的因素包括：选择Z合适的检测技术，读取模式，和实验模型（生物化学，细胞或动物）。通常，这些因素会影响数据质量，生物相关性以及ZL的可预测性，Z终将影响整个临床前药物开发工作的成败。

方法技术的选择

diyi步是确立解决实验问题的技术，例如激活，YZ或调控靶标、阐明MOA（作用机制）、确定受体 - 配体或蛋白质 - 蛋白质的相互作用、鉴定和定量疾病特异性生物标志物或血浆中的生物标志物成分。

样本基质的兼容性

生物标志物测定旨在检测或定量生物学中的靶标样本(例如，复杂基质）中的含量，这种负责基质涵盖范围有：细胞培养中的分泌蛋白，细胞裂解液，组织提取物，唾液，尿液，血清，血浆，血液的上清液，或其他液体（例如，CSF，BALF）。分析技术可能并非总是如此。某些实验方法在某些基质中存在干扰而不适用。例如，在血清，血浆或血液中的血红蛋白表现出广泛的可见光谱吸光度，即在350和600nm之间。检测方法中，依赖于这些波长的激发或发射将容易发生干扰。基于洗涤的检测方法可以避免由于过多复杂基质引起的干扰，因为干扰物质在洗涤过程中被冲走。为了确定基质的相容性，在合适的稀释液中的加标回收和标准曲线是传统的验证方法。

同时，在复杂体系中的抗体选择也是非常重要的，靶标蛋白可能被修饰或者酶切，影响抗原识别位点，因此，加入蛋白酶YZ剂也是有必要的。

实验效果 ：灵敏度和动态范围

 一个实验的灵敏度决定了其在动态范围内的对其靶点的检测的“分辨率”，同时预警了不同批次批次之间的Z低检测范围的差异性。灵敏度同时也依赖于检测样本。血清中的检测难度高于细胞水平。同时“珍贵样品”如有限的细胞或者组织会决定测试的容许体积等。方法技术也会影响检测灵敏度，如发光和荧光的模式比吸收光的模式的灵敏度要好。

动态范围定义了检测下限和上限。例如下图所示，不同的检测技术对于肿瘤坏死因子TNF的检测动态范围达到了数量级的差异。因此，当样品含量超过了其实验方法的动态范围，其浓度，动力学参数，活性，结合力将不准确。因此，需要预先滴定检测窗口以免达到饱和。

下图展示了不同实验技术对于不同的亲和力的适用范围：

特异性

特异性对于确保筛选靶向的靶点或表型非常重要。对于免疫分析，需要考虑针对靶向分析物特异性的抗体，特别是对于靶向蛋白质的部分修饰新表位变化,结合/未结合或活性/非活性状态。此外，还需要考虑物种和靶点的交叉反应性。

稳定性和准确性

尽管信号强度和和性噪比（S/B）通常被用来评估一个实验的质量，可重复性和准确性也是非常重要的。Z’是一个非常好的评判标准。例如，相对而言，高Z’而低信噪比的实验方法好于低Z’高性噪比的实验方法。与此同时，实验发法应当具有高重复性，定量实验应该有标准品做参照。设置好对照，好的标品，抗体，阳性化合物对于建立可靠的实验是非常重要的。

试剂和其他耗材

对于免疫实验来说，高灵敏度和搞特异性的抗体非常重要，同时还有对应的酶或重组蛋白。通常，所有的实验成分，例如细胞、蛋白、酶、辅因子、底物、激动剂，拮抗剂等都需要进行浓度滴定以确定Z优浓度。该过程能够确保稳定的动力学研究以及防止过饱和浓度而产生的试剂浪费。（如下图）

细胞模型

在选择细胞模型时，应考虑使用原代细胞与重组/永生化细胞系的优缺点，以及研究内源性与重组表达的靶蛋白。同时需要评估目标蛋白的表达水平，因为过多或过少的表达会影响灵敏度和分析质量。细胞传代和培养条件也会影响实验质量。

微孔板的选择

正确选择微孔板可以减少交叉效应、降低背景、降低信号吸收或放大信号强度。下表显示了基于检测方法的微孔板选择矩阵。

众所周知，药物研发花费巨大，耗时长。优化已知影响数据质量、生物相关性和ZL可预测性的实验因素Z终推动整个临床前药物开发工作的成功。选择Z合适的分析技术、读取模式和实验模型以及优化实验方案为成功和经济有效的药物开发奠定基础。

我们珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案。例如，我们拥有的均相的Alpha技术以及TRFRET技术，时间分辨defia技术，化学发光技术，细胞增殖和毒性试剂盒，各类GPCR以及动物模型的探针细胞株，微孔板等试剂耗材，能够助力您新药研发的各个环节。

珀金埃尔默能够提供多种实验方法开发的解决方案，欢迎大家关注“珀金埃尔默生命科学”微信公众号了解更多解决方案，期待您的垂询！

关于珀金埃尔默：

珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决Z棘手的科学和YL难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。

了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

类器官是一种由干细胞或成体组织来源的多种细胞类型自组装形成的三维细胞结构，在体外能够长期存活并且可以模拟真实器官的结构和功能。类器官可以为药物开发和组织工程等应用提供快速且经济高效的模型，常用于疾病机制、药物筛选和再生医学等领域的研究[1]。类器官可以分为两大类，来源于胚胎干细胞（ESCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）的体外分化产物和来源于成体组织中存在的干/祖细胞或成熟上皮细胞。类器官的发展经历了从单一细胞类型到多种细胞类型，从静态培养到动态灌流，从单一类器官到多种类器官互联等阶段。目前，科学家们已经成功构建了包括肝脏、肺脏、肾脏、心脏、胰 腺、皮肤、眼睛等在内的多种类器官[2]。

由于类器官技术具有时间短、成本低、生理相关度高等优势，近年来备受科学家的青睐，成为国际顶 级学术期刊的座上宾。作为最 大的一类酶联受体，酪氨酸激酶（RTKs）既是生长因子的受体，也能够催化下游靶蛋白的磷酸化。目前报道共有 58 种 RTKs ，可分为 20 个家族，包括大名鼎鼎的 EGFR 家族，EGFR 家族受体的异常激活与多种肿瘤相关，也是抗肿瘤药物研究的重要靶点[3]。结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是最 常见的恶性肿瘤之一， CRC 的增殖和生存依赖于 RTK 信号通路中的 EGFR ，针对 EGFR 信号通路的抗体药物可以靶向阻断 RTK 信号通路，从而抑 制肿瘤生长[4]。WNT（Wingless-Type MMTV Integration Site Family）信号通路在维持身体的稳态过程中发挥着重要功能，不仅参与调控细胞增殖、迁移、极性和死亡，也参与干细胞的效力维持和分化诱导。WNT 信号通路的异常激活与多种癌症包括 CRC 的发生有关[5]。结直肠癌干细胞（CSC）具有自我更新和分化能力，与结直肠肿瘤的发生、转移和治 疗耐受有着密切的联系。科学家们将 CRC 中 CSC 的靶点作为抗体研发的方向，设计了靶向 WNT 和 RTK 通路的双特异性抗体（bAbs）MCLA-158 ，并研究了其在 CRC 来源的类器官上的有效性与安全性。该研究于 2022 年 4 月发表于《Nature Cancer》杂志上，标题为 “Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors”（图 1）[6]。

图 1 相关文章

类器官来源于患者体内提取的样本，可以在实验室条件下生长，它们通过繁殖可以形成具有某些特性的肿瘤结构。医生为患者制定最 佳 治 疗方案时，类器官可以提供极大的帮助，目前科学家们还在探索特定癌症药物研发过程中类器官的作用。抗体是由身体自然产生的蛋白质，可以用来识别感染因子或变异细胞，使它们被免疫系统的淋巴细胞（白细胞）清除[2]。这篇文章中，研究者利用来自多种上皮肿瘤的患者源类器官（PDOs）作为体外药物筛选平台，从亲和力、稳定性、配体阻断活性等方面鉴定出超过 500 个 WNT×RTK 双特异性抗体（ bAbs），对 500 多种 bAbs 进行功能评价，寻找能够有效抑 制肿瘤干细胞而不损伤正常干细胞的候选药物。科学家们发现了一种双特异性抗体（bAbs）MCLA-158 ，能够同时靶向 WNT 和 RTK 信号通路，特异性地识别并降解 EGFR ，从而抑 制肿瘤干细胞的生长和存活，但对正常的结肠干细胞几乎没有毒性。在体外和体内模型中，MCLA-158 均可以有效地阻断肿瘤转移起始、延缓复发、并且抑 制原发肿瘤的生长。

高内涵成像技术是一种利用自动化显微成像和图像分析软件对细胞、亚细胞或组织的形态、功能和相互作用进行定量和多参数分析的检测方法。高内涵成像技术可以提供丰富的信息，如细胞增殖、周期、死亡、信号通路、标志物表达、共定位等，适合药物筛选和毒性评价等领域的研究。本研究中，科学家们构建和培养了 CRC 患者来源的原发、肝转移、癌旁正常类器官（PDOs）库以及正常结肠黏膜样本（NCOs），对 500 多种 bAbs 进行功能评价，并且使用 Molecular Devices 高内涵成像分析系统对类器官进行药物筛选和功能评价。研究人员使用 ImageXpress 高内涵细胞成像分析系统（Molecular Devices），通过全自动高速显微成像，快速捕获类器官的图像。使用 ImageXpress Micro XLS 高内涵成像分析系统对类器官进行成像（图 2 及图 3），并通过 MetaXpress 图像分析软件，对类器官的形态变化、标志物表达、生长抑 制率等参数进行量化分析（图 3）。使用 ImageXpress Micro Confocal 高内涵成像分析系统捕获类器官的共聚焦图片（图 4）。结果显示 MCLA-158 处理后， EGFR 与抗体共定位并呈点状分布在胞浆内，这表明 MCLA-158 可以将 EGFR 内化。通过高内涵成像系统，研究人员发现 MCLA-158 能够特异性地识别并降解 EGFR ，而且可以抑 制 LGR5 标志的肿瘤干细胞的生长和存活。并且，MCLA-158 抗体不会干扰健康细胞的功能，这对维持组织的正常功能是至关重要的。

图 2 MCLA-158 特征。

图 3 筛选患者源类器官（PDOs）的双特异性抗体（bAbs）。

图 4  MCLA-158 或西妥昔单抗处理后 EGFR 内化和降解。

在药物研发的早期阶段，使用类器官有助于识别对大多数患者有效的抗肿瘤药物。使用健康组织的类器官可以帮助研究人员评估药物对健康细胞的伤害和副作用，从而在研究的早期阶段筛选出毒性较大的抗体[6]。这篇文章展示了高内涵成像技术在类器官药物筛选中的应用和优势，为药物研发过程中对类器官的使用奠定了基础，也为基础医学和转化医学提供了新的思路和方法。

参考文献：

[1]. Jarno D, Hans C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer, 18, 407-418 (2018).

[2]. Aliya F, Si H T, et al. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology, 18, 246-254 (2016).

[3]. Tomas M, Torkel V, et al. Protein tyrosine phosphatases and the immune response. Nature reviews Immunology, 5, 43-57 (2005).

[4]. Sandra M, Rona Y, et al. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature, 486, 532-536 (2012).

[5]. Mazieres J, He B, et al. Wnt signaling in cancer. Cancer Letters, 222, 1-10 (2005).

[6]. Herpers B, Eppink B, et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature cancer, 3, 418-436 (2022).