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  敏姐是个好人0 2009-05-19 00:00:00

  我的论文也是做牛的，比你麻烦多了，有DNA的提取，PCR，PCR-SSCP，测序。 下面是我的操作方法： diyi，冷冻血样于室温解冻。打开水浴锅调温度37℃，打开高速离心机调至4℃，打开制冰机制冰。 第二，取500µl血样加入到1.5毫升离心管中，加入等体积PBS液（500µl），置于有盖的装有冰块的冰盒中，翻转冰盒以充分混匀， 4℃、12000rpm、离心10min。 第三，弃上清，（打散下面的沉淀小块）重复上述步骤中加PBS、离心等，至上清液透明，沉淀呈淡黄色。(一般重复4～5次) 第四，加入DNA抽提液500µl，摇匀，使血细胞沉淀与离心管壁分离，37℃水浴1小时。 第五，加蛋白酶K5µl（20mg/ml）混匀，55℃过夜至澄清（对未澄清者可补加10µl蛋白酶K混匀，继续消化至澄清）。 第六，反应液冷却至室温，加Tris-饱和酚500µl，在有盖的装有冰块的盒中摇匀，混合摇动离心管20 min，使其充分混匀；4℃、12000rpm、离心10min，将上清液用剪去尖头的枪头转入另一个1.5ml的离心管中，重复一次（加Tris-饱和酚500µl，离心）。 第七，加氯仿500µl，充分混匀20min， 4℃、12000rpm离心10min，将上清液再次转移至另一个1.5ml的离心管中。 第八，加氯仿-异戊醇混合液（24:1）500µl混匀20min（以减少反应产生的泡沫），4℃、12000rpm、离心10min，将上清液转入1.5ml离心管。 第九，加入0.2倍体积的NH4Ac缓冲液，再加入2倍体积的冰冷无水乙醇，口底上下翻转离心管混合，至白色絮状沉淀析出，-20℃保存30-60min。 第十，离心：4℃、12000rpm、10min，弃上清，用70%的冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。（加500微升乙醇摇匀后离心，重复上述步骤一次） 第十一，离心：4℃、12000rpm、10min，弃上清，室温下使乙醇挥发干净。 第十二，DNA溶解。干燥后DNA溶于50µl的TE液，4℃保存，直至DNA完全溶解。 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA具体步骤如下： diyi，缓冲液配制：用10×TBE缓冲液贮液稀释为0.5×TBE：取10ml10×tbe缓冲贮存液，加蒸馏水稀释至200ml，摇匀待用；凝胶加样缓冲液含40％（w/v）蔗糖水溶液，0.25％溴酚蓝（4℃保存）。 第二，清洗：将胶床和梳子彻底洗净，晾干，在胶床两端用透明胶布封住，形成挡槽，压紧贴严胶布，确保灌胶时不漏，将梳子插入，将胶床放在工作台的水平位置。 第三，制胶：取12ml的电泳缓冲液倒入锥形瓶中，加入准确称量的0.096g琼脂糖，在微波炉中将悬浮液加热溶解，沸腾除去气泡，将溶液冷却至60℃左右，加入0.6μl的GoldViewTM 染料原液，摇匀后，倒入胶床中，放置30min，使其完全凝固。 第四，分别取1μl的上样缓冲液点在干净的塑料手套上，再加入5.0μl DNA样品溶液并用移液枪吸打混合。 第五，加样：待琼脂糖凝胶完全凝固后，揭掉胶布，拔出梳子，在每个加样槽中用移液枪缓慢加入待检的DNA样品。 第六，加电泳缓冲液：将胶床放入电泳槽，倒入约100ml电泳缓冲液，没过胶面约1mm，并使加样槽内充满缓冲液。 第七，电泳：上样完毕，接通电源，靠近加样槽的一端接负极，80V电压5 min，然后40V稳压电泳30～40min。 第八，照相：待溴酚蓝迁移至胶的2/3处时，切断电源，将凝胶移至BioSpectrum Imaging System中，312nm波长下拍照。

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