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会议简介★

类器官在癌症研究、神经生物学、干细胞研究和药物发现领域变得越来越重要，因为它们可以增强人体组织建模。类器官源于干细胞，并可扩展为多种组织类型，包括肝脏、肺、脑、肾脏、胃和肠。由于这些 3D 微小组织能够模拟体内器官，因此在人类发展和疾病机制方面能为研究人员提供更多见解。

2023 年 3 月 9 日，分析测试百科网联合美谷分子举办本次研讨会，将邀请行业专家，通过与大家共同讨论类器官在肿瘤中的研究现状及应用，希望能对行业内工作者带来帮助和启发。

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会议日程

会议主讲人

蒋明

浙江大学研究员

毕业于复旦大学生命科学学院，获得生物物理学博士学位。先后在美国罗切斯特大学、哥伦比亚大学进行研究工作。长期从事前肠起源的器官包括食管、胃和肺的干细胞在器官损伤再生及在肿瘤中的功能研究。以类器官结合动物模型，鉴定不同类型和起源的干细胞在参与损伤后再生以及在肿瘤形成过程中的作用，已发表一系列高水平 SCI 研究论文，包括 Nature，Journal of Clinical Investigation、Developmental Cell 和 PNAS 等多篇领域内顶 级期刊。承担科技部重 点专项和国家自然科学基金等研究课题。获得国家发明专 利 1 项。

吴霜

Molecular Devices

高内涵产品应用科学家

细胞生物学博士，毕业于中国科学院上海生命科学研究院。具有 5 年显微成像产品使用经验，擅长高端显微镜和共聚焦的使用和分析，目前担任 Molecular Devices 高内涵产品应用科学家。

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6月16日，「“沃”在前沿」生命科学专家论坛直播活动圆满举办！上海科技大学生命科学与技术学院的副院长罗振革教授、向阳飞研究员和南京医科大学药学院的刘妍研究员做客直播间，共同“聚焦类脑器官的现在与未来”。大咖相约，碰撞现在、预见未来，2个多小时的前沿分享与思想碰撞，数千人共襄学术盛宴！

没有赶上看直播

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 按讲课先后顺序，为大家划划重点 

首先，刘妍老师为大家带来“复杂脑区类器官构建及其在神经疾病研究中的应用”的主题分享，主要讲解以下三个方面内容：

1.人多能干细胞及神经谱系定向分化介绍

2.复杂脑类器官构建及其在神经发育疾病研究中的应用

3.中脑类器官的构建及其在神经退行性疾病研究中的应用 

随后，向阳飞老师主要围绕“大脑类器官技术与应用”的主题，对以下三方面内容进行深入研讨交流：

1.大脑类器官技术简介

2.复杂大脑类器官构建

3.大脑类器官与发育疾病模拟

最后，罗振革教授从以下三方面向大家细致讲解了“脑发育及脑类器官”相关知识和前沿进展：

1.脑发育基本过程

2.利用脑类器官解析脑发育机理

3.脑类器官的血管化

为了更好地服务此类型研究，瑞沃德推出了单细胞与类脑器官研究解决方案，全方位助力类器官制备和培养、类器官移植模型构建，模型功能检测、调控机制探究等类脑器官研究的顺利开展。瑞沃德细胞与分子研究解决方案专家冯启峥为大家进行详细介绍。

 答疑互动环节精彩回顾 

在专家互动在线答疑环节，除了以上三位大咖，还邀请到罗振革教授团队的孙新尧博士，四位老师共同解答线上观众们的提问。

“类脑器官在哪种疾病中会有较快突破?”
“是否可以通过一些诱导因子促进胶质细胞的生长?”

“能否通过移植造血干细胞形成血流?”……

如果这些问题你也感兴趣，进入直播回顾即可找到答案。

更多精彩答疑互动识别下方二维码即可观看

下期「“沃”在前沿」直播活动
将在7月份推出，敬请关注~

「“沃”在前沿」论坛，是由瑞沃德举办的聚焦生命科学国际学术前沿的高端对话活动。每期特邀行业专家/学者，分享其当下深度研究的课题，从学术、实践、技术、商业等多维视角，探讨前沿新知，分享独jia洞见，碰撞未来趋势，让思想影响科学，帮助科研人员开阔科研视野，拓宽研究思路。

12月5日，由TA仪器与沃特世主办、材料人承办的OLED技术发展与应用线上研讨会取得圆满成功。会议从OLED材料与柔性技术的研究进展、制造工艺、表征技术及市场趋势等方面进行了深入探讨。

会议直播部分概览如下：

报告人：孟鸿

北京大学深圳研究生院讲席教授，

博士生导师，特聘专家

报告人：李润明

TA仪器技术专家，上海交通大学材料学博士

报告人：蔡麒

沃特世大中华区材料科学市场高级经理

报告人：段羽

吉林大学电子科学与工程学院教授,博士生导师

全程录像回看请扫描下方图片二维码

       槲栎树叶多为长椭圆状倒卵形至倒卵形，壳斗杯形，坚果为椭圆形至卵形。槲栎叶片大且肥厚，叶形奇特、美观，叶色翠绿油亮、枝叶稠密，属于美丽的观叶树。

       本文采集到不同地理位置、不同海拔高度和不同经纬度的槲栎树种群的树叶，来探讨这些槲栎树叶氮含量的差异。结合其他实验室数据来研究栎类树的遗传变异与地理、气象等之间的关系。

凯氏定氮法测槲栎树叶中的氮含量

仪器与试剂

1、仪器

K1160全自动凯氏定氮仪，SH420F石墨消解仪，分析天平。

K1160全自动凯氏定氮仪

SH420F石墨消解仪

2、试剂

       硫酸（分析纯），催化剂片（分析纯无水硫酸钾3g和分析纯无水硫酸铜0.2g），20g/L硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠。

实验方法

1、取样

       将风干后的树叶撕碎，精确称取样品0.2g左右（精确值0.1mg），放入消化管内，然后分别加入3g硫酸钾与0.2g硫酸铜，沿消化管壁加硫酸10mL。

2、消解

       利用石墨消解炉进行消解，将消化管放在石墨炉上，盖上排气罩，连接废气吸收系统，消化过程采用曲线升温模式，设定消解参数如表1：

表1 消解参数设置

3、测试

       将消化管放置于凯氏定氮仪上，定氮仪参数设置如表2：

表2 定氮仪参数设置

结果与讨论

1、实验结果

2、讨论

       通过实验数据可以看出，不同地理位置，不同海拔高度槲栎树叶中的氮含量是有差异的。

写在前面的

① 水稻高产栽培是解决世界范围内日益增长的粮食需求的有效途径，而对高产水稻进行正确分类是育种的关键。

② 然而，在育种项目中人工测量耗时、成本高、产量低，这限制了在大规模现场表型的应用。

③ 因此，研究者开发了一种低成本、高通量表型分析和无损检测的方法，将无人机高光谱测量和深度学习相结合，以提高水稻育种效率。

研究背景

水稻是世界上主要的栽培作物之一，是许多国家的主要粮食来源。水稻的种植面积仅占耕地总面积的7%，却养育着21%的人口。近年来，粮食生产增长速度明显放缓，而世界一些地区的粮食需求却在增加。

在ZG，预计到2030年，对大米生产的需求将增加约20%，巨大的需求遇到了巨大的挑战，劳动力人口减少，耕地质量下降，水资源短缺，气候变化等。因此，选育高产水稻品种，提高单位产量，是解决粮食需求缺口的有效途径。

在水稻育种过程中，准确地预测产量是高产品种筛选的关键，而迄今为止，该工作很大程度上依赖于人为经验评估，存在主观随意性和不能规模化等限制。因此，高通量表型分型系统正在迅速发展，在许多育种项目中，遥感工具如RGB相机和多光谱、高光谱、荧光和热传感器都被用于数据采集。随着无人机技术和光谱成像技术的进步，基于无人机的高光谱相机在农业生产中的应用越来越广泛。

基于无人机的高光谱图像数据采集

近日，Plant Phenomics在线发表了宁夏农林科学院农作物研究所、福建农林大学林学中`心、中科院地理信息研究所合作的题为Classification of Rice Yield Using UAV-Based Hyperspectral Imagery and Lodging Feature的研究论文。

研究者首先按照亩产将13个宁夏北方区试中早粳中熟组水稻划分为高产、中产和低产三个类别。而后利用DJI M600 Pro无人机，配备GaiaSky-Vis&Nir高光谱相机采集高光谱图像，并结合水稻后期倒伏特征，借助机器学习算法(XGBoost)构建水稻产量类别检测模型。该模型对在试验区的13个水稻品种产量进行预测，结合实际的产量进行比较发现该模型对高产品种的识别具有极高的准确度。

▲试验区分布图

该高光谱相机的分辨率为960×1057像素，在飞行高度为90m时的空间分辨率为4.5cm，其波长范围从400到1000nm，光谱分辨率为3.5nm，每张图像的曝光时间为7s。水稻光谱曲线与周围土壤不同。在数据采集前，研究者们对农田进行了检查，确保稻田中只有水稻，没有其他杂草，避免干扰高光谱数据。

高光谱图像预处理工作流程包括数据校准、噪声，背景去除和ROI的选择。研究者还进行了随机非重复采样、植被指数计算和数据降维。将高光谱数据、植被指数和倒伏特征组合成一个数据库，ZH将数据分为训练库和测试库。

▲高光谱处理流程及各种分析策略的模型评估

由于倒伏标记对更好地估计产量有重要意义，本研究同时设计了基于深度学习的倒伏检测模型来对水稻的倒伏特征进行量化，并获得了较高的倒伏预测准确度。结果表明，利用深度学习技术实现水稻倒伏的自动识别是可行的。

▲利用微调技术自动识别水稻倒

Gaia-Vis&Nir作为针对植被、农作物（小麦、玉米）等理化、生理指标长期监测系统，采用了高灵敏度、高光谱分辨率、宽光谱范围的探测器。在ARM 系统下对探测器、温度传感器、制冷系统、采集系统、转镜结构、电子Shutter、辅助拍摄区域视频监控等功能的控制。

反射光谱测量的是植被生化组分等对入射光谱的吸收信息，能够反演植物群体的生化组分浓度信息。通过获取植被冠层在350nm- 1700nm范围内的反射光谱信息，可反映植被冠层的生长状态及生化组分信息。

例如，利用作物水分敏感波段960nm/1450nm处的反射率可判断作物叶片、冠层的含水量关系。综合考虑叶片内部结构、叶片水分含量以及干物质等的影响，利用1600nm与820nm的反射率比值建立与等效水厚度EWT（Equivalent Water Thickness）的相关性。

▲Gaia-Vis&Nir植被冠层可见&近红外反射光谱测试、太阳光诱导叶绿素荧光测试系

近日，2020年ZX癌症负担报告由世界卫生组织下属国际癌症研究机构（IARC）发布，报告对2020年度常见的癌症类型、导致死亡主要癌症类型以及未来的癌症发展趋势进行了全面的分析。

2020年最常见新发癌症类型及占比

　　
　　肿瘤研究领域是全世界的科研热点，随着对肿瘤研究的白热化，越来越多的科学家需要从肿瘤组织里来获得细胞，从而建立原代肿瘤细胞系、分选肿瘤干细胞或者其它细胞以进行下游的信号通路检测、药物试验、疾病发生等。在对肿瘤细胞的研究中，从肿瘤组织中获得细胞的DY步就是制备单细胞悬液。那么，细胞悬液制备一般原则是什么呢？

细胞悬液制备一般原则

　　
　　传统的单细胞悬液制备方法有机械法、酶消化法以及两者的组合等，这些方法需要繁琐的操作过程，费时费力。净信单细胞悬液仪将会使单细胞悬液制备变得快速、简单。仅需30min即可获得大量单细胞悬液，细胞活性可达80%以上，具有自动温控的特点。样品范围包括人类及小鼠肿瘤组织/正常组织，哺乳动物软组织，植物愈伤及根尖组织。

　　SM-12型单细胞悬液仪器，由净信实业发展有限公司自主研发，核心成员在上海交通大学、上海市中山医院、中科院药物所等国内外知名高校或者企业从事多年产品开发或者技术研究。公司将分子生物学、细胞领域的高科技人才有效聚集在一起，突破现术瓶颈，突破进口垄断，开发出了单细胞悬液仪器。
　　
　　从组织获得存活单细胞是一个复杂过程，目前市面上组织单细胞化的方法有采用机器处理或者人工处理方法,以上处理方法均存在处理时间长、细胞处于逆境状态时间长、 细胞得率低、细胞存活率低、操作繁琐等问题。单细胞悬液仪结合特定组织松解剂，快速、轻柔、安全、简捷、GX、自动化的从组织如（脂肪、骨骼肌、动脉血管内皮、心脏、肝脏、pi脏、肺泡、肾脏、脑、肿瘤）30min内全自动完成组织单细胞的解离。

操作流程

　　
　　净信单细胞悬液仪可应用于单细胞测序、多色流式分析、质谱流式细胞技术、原代细胞分离培养、细胞ZL等。具有组织利用率高、单细胞化过程GX、大细胞高产出的优势。
　　
　　使用净信单细胞悬液仪，让科学研究变得简单GX。

日本东京庆应大学医学院器官医学系与胃肠病学系的科学家利用Wes，继Cell（IF：36.216），Cell Stem Cell（IF：21.464）发表文章后，再发Nature（IF：43.07）：Somatic inflammatory gene mutations in human ulcerative colitis epithelium, Nature, 577 (7789), 254-259 Jan 2020.

研究摘要：

正常的人体组织会不断自我更新，以维持体内稳态。在自我更新的重复周期中，体细胞不可避免地发生基因突变，即会引起带有癌症突变的体细胞克隆的扩增。然而，在非肿瘤性结肠中，是否存在癌变的克隆扩增是未知的。本研究通过对76个克隆的人结肠类器官的全外显子组测序，确定了溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）患者的上皮细胞中独特的体细胞诱变模式。其炎性的上皮细胞中，存在与IL-17信号通路相关的多个基因的体细胞突变，包括NFKBIZ，ZC3H12A和PIGR，但这些基因在结肠癌中很少发生突变。利用CRISPR敲除技术，验证了这些体细胞突变会YZIL-17A诱导的促凋亡反应。人结肠上皮的体细胞诱变可能与炎症过程有因果关系。本研究通过对溃疡性结肠炎类器官的遗传分析，揭示了慢性组织炎症过程中体细胞进化的模式，以及其对溃疡性结肠炎发病机理的潜在影响。

类器官命名及分类

Wes检测IL-17信号通路蛋白：IL-17RA, Caspase-3, PIGR, IκBζ的蛋白表达：

所有结果为全膜结果

Wes/Jess全自动定量Western Blot特点

全程自动化，无需检测人员值守

从样本到结果， 全程3小时

标准曲线定量检测病人样本靶蛋白浓度

微量样本

数据可追溯

自动数据计算存储

（来源：ProteinSimple）

显微CT分析可用于牙科研究中的各种应用，如牙釉质厚度、根管形态、根管预备、颅面部骨骼结构、显微有限元建模、牙体组织工程、牙硬组织矿物密度及种植体等方面。它可以提供高分辨率图像以及牙齿、骨骼和植入物的定性和定量分析。      

根管是一种孔隙，这种在牙齿中间的低密度空间对牙髓病的研究起了可探索的方向。显微CT在牙科填料的研究上，特别适用于三维定量评价根管充填物。

牙釉质厚度在人类进化中具有分类学和系统发育价值。显微CT有效且无损的技术特性被用于测量各种考古标本的牙釉质厚度。在临床研究中，牙釉质厚度被认为对于咬合负荷方案的解释具有重要意义。

实例2：大鼠下颌骨和舀齿

大鼠或小鼠下颌骨和臼齿在牙周病和其他牙科相关领域的许多研究模型中有着重要价值。通过显微CT对动物下颌骨和牙齿的测量研究，可进一步分析牙周生物型各特征之间的相关性,为口腔美学修复、种植ZL方案的选择、ZL预后的判断以及LX的评估提供理论基础

实验设备：VENUS® Micro-CT 

            中文名：桌面型高分辨显微CT

            型号：VNC-100

影像软件：Avatar 1.3 （平生YL科技）

白酒中酯的含量对白酒的质量有决定性作用，不同等级的白酒有不同的酸酯要求，只要是按正常酿造工艺生产的白酒，甲醇等物质的含量是不应超过限量标准。有关白酒检测，以下问题，您是否了解？认真读完下面 Q & A ，码上注册，可获“终 极应用宝典”！

Q1如何在甲醇检测中避免聚焦变形的问题？

是小分子量的时候，需要采用气相色谱、小分流比安股金后研磨柱。

Q2如何处理乙酸、乙酯的分离？

低温 35 度保持 4 分钟，要考虑通用性，结合不同气候和天气条件下的室内温度，还要考虑白酒中大比例的水，能达到 1.5 的分离度就很好。

Q3不同温度下，白酒检测如何优化分离度？

温度很关键，把温度降到 40 度，对分离度有帮助。

Q4气化好坏对重复性的影响如何解决？

大分流比的情况下要有足够的温度和充足的玻璃膜。

Q5空气压力波动会对基线产生影响，怎么办？

高压钢瓶的输出压力比较稳定，可以考虑采用高压钢瓶。

Q6 白酒检测平均多久出样？

平均 55 分钟左右一个样。

想要了解更多白酒检测关键操作的最 优操作吗？扫描下方二维码，观看安捷伦气相色谱产品线资 深技术工程师那顺老师针对白酒分析关键问题的讲解和实验结果解析。

样品前处理技术是分析化学的重要组成部分,也是一个十分重要的步骤；而在实验室活动中，标准物质的合理使用是保证测量结果的可比性和一致性，实现测量量值统一和有效传递。本次线上研讨会伟业计量邀请了三位检验检测领域的专家，他们围绕备受关注的元素分析前处理技术及标准物质的选择和应用议题展开线上讨论。

课程简介

讲师∶伟业计量

专业领域∶检验检测领域

所在单位∶北京北方伟业计量技术研究院

讲师简介∶北京北方伟业计量技术研究院是国家标准物质研制单位。秉着高标准、高质量以及高品质的团队精神，一直致力于标准物质的研发与申报工作。迄今为止，已成功申报近500项国家 级标准物质，自主研发产品达到8000余种，并通过ISO9001质量管理体系认证。主要涵盖有食品药品、环境监测、临床化学、金属成分监测、生物试剂等领域，独立研制十二大系列国家标准物质，并提供各种不同浓度的单标及混标定制服务。

课程回放

“我们倾向于忽视大自然所提供的隐藏细节。”而在显微镜之下，细节呈递至眼前，生命之美无处不在。

由伯桢生物科技（杭州）有限公司（下称“伯桢生物”）和徕卡显微系统(上海)贸易有限公司（下称“徕卡显微系统”）联合举办的首届“徕伯杯”3D细胞培养和类器官摄影大赛自2022年9月15日开幕以来，受到了国内3D细胞培养和类器官研究领域相关科研工作者的热切关注和广泛好评。历经四个月的作品征集，网络投票和专家组评审，最终大赛分别评选出一等奖1名、二等奖2名、三等奖6名、专项奖6名，以及阳光普照奖44名。

本期推文与大家共同欣赏，2022年首届“徕伯杯”3D细胞培养和类器官摄影大赛三等奖作品——来自清华大学第 一附属医院的张凤枝所拍摄的肿瘤类器官。

作品介绍

作者

张凤枝    清华大学第 一附属医院

样本介绍

投稿作品拍摄的类器官类型：

肿瘤类器官

简要介绍研究用途和研究方法：

样品类型：心脏类器官

研究用途：揭示多谱系细胞形成心脏类器官过程中的细胞命运转变及潜在的基因调控机制

研究方法：单细胞测序分析，流式细胞分析，免疫细胞化学染色等

奖品

东芝2T移动硬盘

三等奖定制奖牌 & 证书

专家点评

 概述

基于 T 细胞的疗法正在迅速发展成为许多癌症的有效一线ZL选择。近年来， FDA 已经批准了几种针对免疫检查点的ZL性抗体和小分子用于临床，以补充和提高T 细胞的靶向性和有效性。这些免疫检查点YZ剂的临床前筛选需要强大的体外肿瘤模型来评估 T 细胞杀伤效率。但是，传统的 2D 肿瘤模型通常缺乏生物学相关性和复杂性来预测体内或临床结果。 3D 生物打印平台以及许多其他 3D 培养方法，提供了在生理上更相关的组织模型中自动筛选各种分子和药物的潜力。在此，在此概念验证研究中，我们描述了小鼠肺癌的同系生物打印肿瘤模型，以在细胞细胞毒性测定中评估免疫检查点YZ剂（PD-1）。在生物印记的肿瘤中观察到 T 细胞浓度依赖性杀伤， 并且添加免疫检查点抗体进一步增强了 T 细胞杀伤效力。有人建议，生物打印的 T 细胞细胞毒性测定法可能使研究人员能够在更有效的转化模型中筛选检查点YZ剂。

引言

       T 淋巴细胞（T 细胞）在实现对传染病和癌症的长期免疫中起着至关重要的作用。 T 细胞可以在感染或癌细胞表面上的主要组织相容性复合物（MHC）分子的背景下识别特定抗原。这种特异性识别导致 T 细胞分泌有毒颗粒，从而特异性杀死靶细胞。传统上，已经使用在二维（2D）单层中生长的靶细胞进行了 T 细胞杀伤（细胞毒性）测定（Golstein，2018）。这些 2D 分析可通过成像或其他方式快速轻松地进行终点分析。但是，在人体内部，T 细胞介导的靶细胞杀伤发生在三维（3D）环境中，这归因于 T 细胞迁移或渗入 3D 组织核心的其他障碍。因此，3D T 细胞细胞毒性测定法在生理上更相关，并被认为可以更好地预测体内实验的结果。在免疫刺激剂的临床试验中，使用三维肿瘤模型进行细胞毒性试验越来越受到关注。

检查点阻断疗法的ZX发展彻底改变了癌症ZL领域，通过YZ免疫检查点来增强 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤（Topalian，2016）。几种检查点YZ剂，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗体，已被批准用于临床（Sharon，2014 年）。然而，开发高通量 T 细胞毒性测定法以快速和低成本地筛选此类YZ剂的需求仍然没有得到满足。

      已经研究了几种 3D 肿瘤模型，包括球状体、悬滴和微流控芯片模型，用于 T 细胞细胞毒性测定。 例如，胶原蛋白-纤维蛋白凝胶用于在 3D 环境中生长癌细胞，以确定杀死所有癌细胞所需的 T 细胞的JD浓度（Budhu，2010）。最近，微流体球体培养用于免疫检查点封锁的体外分析（Jenkins，2018）。 尽管这些模型在模仿体内环境的某些方面显示出希望，但它们通常通量低或无法考虑细胞外基质（ECM）在肿瘤生物学中的关键作用。

      生物打印是一项新兴技术，使研究人员能够自动化制造肿瘤构建体以筛选抗ai药或免疫刺激剂。该技术沉积了一种充满细胞的 ECM 材料（通常称为生物墨水），与肿瘤细胞混合，随后进行化学或热固化，从而为打印结构提供机械强度。在这里，我们探索了3D T 细胞细胞毒性测定法的生物打印技术的潜力，以帮助评估免疫检查点YZ剂。

材料和方法

细胞准备

为该项目选择了小鼠肺癌细胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 细胞。两种细胞类型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）从美国典型培养物保藏ZX（ATCC）获得，并根据建议的方案进行培养，每 3 至 4 天传代一次。 为了促进活肿瘤细胞的成像，将编码红色荧光蛋白（RFP）的质粒引入 LLC-1 细胞，以生成稳定的 LLC-RFP 细胞。LLC-RFP 细胞（此后称为“LLC-1”）用于其余实验。按照先前发布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培养 OT-1 脾细胞并将其灌注 5 天。 在第 5 天的共培养研究中，未经进一步纯化就使用了引发的细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）。

生物墨水的制备和生物打印

中和胶原蛋白 I（CELLINK），并与每毫升胶原蛋白中的 106LLC-1 细胞混合。将所有组件（包括注射器，针头和针尖）置于冰上，直至准备使用。将温度控制的打印头（TCPH）设置为 8°C，而将打印床设置为 10°C。使用 BIO X（软件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中对三维 LLC-1 肿瘤进行生物打印（见图 1）。印刷后，将 96 孔板转移到 37°C 的恒温培养箱中 20 分钟，以使胶原蛋白聚合。接下来，将 200 µL DMEM 培养基添加到每个孔中。 媒体每 3 天刷新一次。 肿瘤生长 5 天，然后与 T 细胞共培养。

图 1. 肿瘤的三维（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用胶原蛋白对 Lewis 肺癌细胞（LLC-1）进行胶原蛋白印刷。将胶原蛋白液滴（肿瘤）热固化并在 DMEM 培养基中保持 5 天，然后再与 T 细胞共培养。

 在第 4 天，将打印的肿瘤与 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小时，以使肿瘤细胞表达相关抗原。 在第 5 天， 洗涤打印的肿瘤， 并以不同的效应子与靶标（ E∶T） 比

（0∶5）与 T 细胞共培养 48 小时。对于阳性对照，将肿瘤与依托泊苷或 TNFα孵育以诱导细胞凋亡引起的细胞死亡。 阴性对照孔未接受任何 T 细胞或凋亡诱导剂。对于抗原特异性，少数（n = 8）孔中的肿瘤未用 SIINFEKL ZL，但接受了引发的 T 细胞。为了进行免疫检查点分析， 将引发的 T 细胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗体（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）预处理 1 小时，然后将其加入与肿瘤的共培养物中（n = 8）。保留 IgG 同种型对照用于比较。

影像和统计

如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 荧光的损失被用作肿瘤细胞死亡的读数。 使用 EVOS Auto 2 荧光显微镜进行成像。 使用 ImageJ 软件（NIH）测量荧光强度，并使用 Graphpad Prism 8 进行图形翻译和制备。通过使用学生的 t 检验在 Prism 中对统计结果进行统计，数据表示为平均值±SEM。

结果与讨论

肿瘤细胞生长和球状体形成

      BIO X 上的液滴功能能够自动将稳定的胶原蛋白肿瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形状和孔位置的均匀性有助于整个显微镜和分析工作流程。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用 Calcein AM 染色以确定细胞活力。 图 2 中显示的结果表明，LLC-1 细胞在第5 天在打印的肿瘤中是可行的。此外，这些细胞被限制在胶原蛋白内，而不是逃逸其结构以在 2D 表面上生长。

图 2. 肿瘤细胞的生长和生存力。 对打印的肿瘤进行 RFP 荧光成像，并用钙黄绿素 AM 染色以确定 T 细胞筛选前第 5 天的细胞活力。

3D 中的 T 细胞细胞毒性测定

T 细胞介导的细胞毒性被定量和定性验证。 当将肿瘤与 T 细胞共培养时，观察到肿瘤细胞活力的 T 细胞浓度依赖性降低（见图 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，与无 CTL 对照相比，观察到了肿瘤生存力的统计学显着降低（p=0.0003）（〜30％）。 在存在或不存在 T 细胞的情况下，打印肿瘤的代表性图像显示在图 3B中，当在共培养物中存在 T 细胞时，RFP 荧光显示出质的下降。T 细胞能够附着在胶原屏障上并在 3D ECM 环境中与癌细胞相互作用。

图 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的肿瘤模型进行 T 细胞细胞毒性测定。（A）观察到 T 细胞浓度依赖性地降低了肿瘤细胞的活力，这是通过 RFP 荧光的丧失来确定的。 CTL 的数量代表每孔的总 CTL。 （B）显示了在存在或不存在 T 细胞的情况下打印的肿瘤的代表性图像。 使用相同的采集参数拍摄图像。

免疫检查点测定

为了扩大 T 细胞杀伤的效用或限制，将肿瘤与经抗 PD1 抗体预处理的初免 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。如图 4 所示，与同种型对照相比，使用抗 PD1 抗体阻断 PD-1 / PD-L1 轴显示出 T 细胞介导的肿瘤细胞杀伤的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 检查点的阻滞，引发的 T 细胞能够更有效地附着在胶原蛋白屏障上， 更有效地浸润和杀死肿瘤细胞。

图 4. 免疫检查 （A）显示了免疫检查点阻断测定的示意图。 单克隆抗 PD1 抗体阻断了 PD1 与 PD-L1 之间的相互作用，从而增强了 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤力。（B）在 IgG 同种型对照或抗 PD1 抗体存在下，将 3D 生物打印的肿瘤细胞与初免化的 T 细胞以 5：1 的 E：T 比例共培养。 PD1 阻断显示出对靶细胞的增强杀伤作用。

结论

v 3D 生物打印技术可用于 T 细胞细胞毒性测定中，以用胶原蛋白打印 RFP 标记的鼠类肺癌细胞。

v 生物打印的肿瘤细胞在胶原蛋白基质内仍然被限制和存活。 观察到 T 细胞浓度依赖性的细胞毒性增加。

v 如文献所述，抗 PD-1 抗体的使用增强了 T 细胞介导的杀伤效率。

v T 细胞细胞毒性测定与高含量成像工作流程兼容，还可以适应其他肿瘤模型，包括患者来源的异种移植，以加快药物筛选过程并推动个性化药物的临床转化。

v 进一步的研究可能包括通过生物打印的肿瘤细胞对抗原呈递的定量，肿瘤中 T 细胞的浸润以及 T 细胞表达的细胞因子。

v 此外，BIO X 上的多孔生物打印格式可用于扩大对生物试剂（例如免疫检查点YZ剂）和工程 T 细胞（CAR-T）的高通量筛选的支持。

参考文献

1. Budhu, S., Loike, J. D., Pandolfi, A. CD8+ T cell concentration determines their efficiency in killing cognate antigen-expressing syngeneic mammalian cells in vitro and in mouse tissues. Journal of Experimental Medicine. 2010; 207(1): 223–235. DOI: 10.1084/jem.20091279.

2. Golstein, P. and Griffiths, G. M. An early history of T cell-mediated cytotoxicity. Nature Reviews Immunology. 2018; 18(8): 527–535. DOI: 10.1038/s41577-018-0009-3.

3. Jenkins, R. W., Aref, A. R., Lizotte, P. H., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. 2018; 8(2): 196–215. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-17-0833.

4. Nath, S., Christian, L., Tan, S. Y., et al. Dynein seperately partners with NDE1 and dynactin to orchestrate T cell focused secretion. Journal of Immunology. 2016; 197(6): 2090–2101. DOI:10.4049/jimmunol.1600180.

5. Sharon, E., Streicher, H., Goncalves, P., and Chen, H. X. Immune checkpoint inhibitors in clinical trials. Chinese Journal of Cancer. 2014; 33(9): 434–444. DOI: 10.5732/cjc.014.10122.

6. Steff, A.-M., Fortin, M., Arguin, C., and Hugo, P. Detection of a decrease in green fluorescent protein fluorescence for the monitoring of cell death: An assay amenable to high-throughput screening technologies. Cytometry. 2001; 45(4): 237–243. DOI: 10.1002/1097-0320(20011201)45:4<237::AIDCYTO10024>3.0.CO;2-J.

7. Strebel, A., Harr, T., Bachmann, F., et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis. Cytometry. 2001; 43(2): 126–133. DOI: 10.1002/1097-0320(20010201)43:2<126::AID

CYTO1027>3.0.CO;2-J.

8. Topalian, S., Taube, J., Anders, R. et al. Mechanism-driven biomarkers to guide immune checkpoint blockade in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 2016; 16(5): 275–287. DOI: 10.1038/nrc.2016.36.

2020年10月23日，美谷分子仪器（上海）有限公司 Molecular Devices 2020 第八届高内涵用户会议在杭州城中香格里拉大酒店成功召开。本次会议共吸引近150位来自高校、医院、科研院所以及企业专家、学者到场参会。会议还进行了线上同步直播，共有200余位未能到场的客户报名参加。

会议现场

会议由 Molecular Devices 成像系统高级产品经理艾平主持，总经理严洁敏先生致开幕词并向与会人员介绍丹纳赫集团与MD公司概况，诠释了“生根ZG、聚焦ZG”的理念。7位来自不同领域的用户专家围绕高内涵成像的应用做了精彩报告。

Molecular Devices ZG区总经理 严洁敏先生致开幕词

这7位演讲嘉宾都是在自己的领域内有所擅长，报告涵盖了多个主题：多凹面细胞三位培养体系、炎症免疫反应与心肌再生、高内涵分析系统在生命科研平台中的运用、缺氧缺血性脑损伤、中药药效、多肽的抗感染以及高内涵的实验应用分享。除此7位专家外，Molecular Devices 市场发展经理何佳霖介绍了高内涵的使用技巧，如何选择耗材，更好地帮助科研人员做好实验。

苏州大学医学部教授 张乐帅

报告题目：《多凹面细胞三维培养体系与适配高内涵系统的展望》

张博士阐述了一种新的细胞三维培养方法，在琼脂糖面上压印出多个凹面，便于细胞成球；同时也进一步规划了多凹面组织培养片，使细胞培养进入一个新时代。

ZG医学科学院阜外医院副研究员 聂宇

报告题目：《炎症免疫反应与心肌再生：机制与靶点》

聂博士课题组应用新生小鼠心肌再生模型，探讨了炎症免疫反应在心肌再生中的作用和机制，并开发了一系列潜在干预靶点，为心力衰竭的ZL提供了新思路。

上海中医药大学公共技术服务平台主任 杨扬

报告题目：《高内涵分析系统在生物学科研平台中的共享运行》

杨博士以基于高内涵成像分析系统的方法学开发为案例，探讨如何通过多方协作推动实验平台的内涵建设。

军事医学研究院毒物药物研究所副研究员 骆媛

报告题目：《缺氧缺血性脑损伤ZL药物评价及机制研究》

骆博士研究了药物对脑缺血的治LX果，证明了通过调控线粒体能量代谢、以及神经元可塑性等机制，促进神经生长以及新生血管形成，恢复脑血流，减轻氧化应激损伤。

浙江大学药学院教授 王毅

报告题目：《高内涵分析技术在中药药效物质研究的应用》

王博士介绍了浙大药物所与MD公司共建的高内涵成像平台情况，并对高内涵分析技术在中药药效物质研究中的前景与未来发展方向做一展望，以期待更多合作交流。

重庆大学药学院副研究员 张金强

报告题目：《基于多肽的抗感染及抗 癌药物发现》

张博士成功开发了一种新型阳离子桥联KJ肽修饰策略，并发现一类具有良好酶稳定性、低细胞毒性的阳离子KJ肽，对于多种癌细胞系具有明显的YZ作用，具有开发成为新型抗 癌药物的重要潜力。

中山大学孙逸仙纪念医院平台主管 王永强

报告题目：《高内涵在光学显微成像平台的应用》

王博士在报告中围绕细胞周期、细胞增殖、细胞焦亡、细胞通讯和细胞再生几个方面，对相关成像系统进行简要介绍。

Molecular Devices 市场发展经理 何佳霖

报告题目：《高内涵产品与应用新知》

何博士介绍高内涵相关产品更新，并分享如何运用zui新的耗材与试剂，简化样本制备、提升拍照质量与通量、及加速影像分析与数据处理。

现场听众和线上网友在每次报告结束时，与报告专家也进行了积极的问答互动。

现场观众&线上网友提问

与会嘉宾合影

在会议茶歇与午休期间，Molecular Devices 展示了样机共聚焦高内涵成像分析系统ImageXpress Micro Confocal与自动化细胞成像分析系统ImageXpress Pico,应用工程师们现场操作仪器、展示软件分析模块及用软件进行图像处理分析，让参会观众更深入直观地了解我们的仪器及分析软件，同时体验到操作分析的简便及智能化。

现场观众与Molecular Devices工程师交流

会议现场还组织了3次抽奖活动，给幸运参会人员送出了精美礼品。Molecular Devices 会一如既往以客户为ZX，提供良好的售前售后服务，满足各类学者及研究人员的科研需求。期待明年第九届高内涵用户会议再次相见！

如何正确理解聚合物分子量及其分布？它包含哪些表征技术？分子量分布对黏流曲线和对动态模量分别都有哪些影响？本次课程TA仪器李润明博士就将在这一节的流变小课堂当中为大家剖析多个相关知识点：

GPC法分子量的标定及分布曲线

零切黏度对分子量的关联关系

案例——动态模量法评估聚合物分子量及其分布

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