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　　实验室细胞培养板步骤

　　1、细胞复苏

　　将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM培养基中(其中胎牛血清约为10%)，轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。

　　加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5%  CO2的细胞培养箱中培养。

　　2、细胞传代

　　当细胞密度达到80%~90%(过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数)时，去掉培养基，用1X  PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶(注意：消化液的量以盖住细胞，消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度)进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

　　加入适量DMEM培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。

　　加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

　　3、细胞冻存

　　当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X   PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液(90%胎牛血清，10%DMSO。   一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞)，放入冻存管内(管内有异丙醇，以温度降低的速度)，立即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放人液氮，可以保存三个月。

　　细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

　　4、注意事项

　　(1)预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热;

　　(2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手;

　　(3)正确摆放使用的器械：足够的操作空间，不仅便于操作而且减少污染;

　　(4)点燃酒精灯：注意火焰不能太小;

　　(5)严格的无菌操作;

　　(6)贴壁细胞消化适度：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化;

　　(7)传代细胞所有的操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作，每种细胞使用一套器材。避免交叉感染;

　　(8)传代细胞瓶口每次打开或者关闭都需要在酒精灯上消毒。

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自1665年，英国科学家Robert Hooke发现细胞并命名为cell，到德国生物学家Matthias Jakob Schleiden和Theodor Schwann提出的细胞学说，人类对这个组成我们生命的相对独立单位——细胞，有了更加清晰的认识。

为了更好地了解生命的本质，揭示细胞基本的生命活动规律，科学家们围绕着细胞的增殖、运动、代谢、死亡等活动展开了一系列研究。其实早在19世纪，就有人提出将活体细胞从组织中分离出来的概念，但是直至1950年才开始进行动物细胞的培养研究。由最开始简单的观察到从组织中分离原代细胞再到获得可持续传代的无限细胞系，细胞从一个虚无缥缈的概念到现在作为体外研究实验时必不可少的实验材料，贯穿了整个生物学发展史。

研究常用的细胞主要分为两种：直接从组织上分离的原代细胞和购买的细胞系，通常将从组织上分离获得的第一代到第十代内的细胞统称为原代细胞，而大部分原代细胞会在此之后逐渐生长停滞并衰老死亡，极少量能继续存活至第五十代以后的细胞遗传信息发生了改变，成为无限细胞系或连续细胞系，一般的无限细胞系只具有永生性的特点，还有一些细胞的接触抑制消失，可以多层生长，甚至在异体接种后还有致瘤性。

因此无限细胞系由于其永生和快速分裂的特点一直是细胞水平研究时的首 选，由于方便培养、种类繁多、生长速度快且成本较低，可以快速开展研究，使得各种无限细胞系被广泛应用。例如Hela细胞作为第一株可无限传代的人类细胞系，帮助科学家们更加高效地专注人体细胞疾病和活性药物作用机制的研究，广泛应用于肿瘤学、免疫学、病毒学等学科领域。

近年来研究发现，虽然无限细胞系“浑身是宝”，但在应用上还是有一些限制。

限制1

细胞的生物学特性改变

在研究过程中由于需要大量的样本，无限细胞系需要快速繁殖并扩大培养，而其在连续传代培养过程中会发生一定突变，无限制地连续传代可能导致细胞系的基因型和表型都发生改变，从而影响实验结果。

同时，永生化的无限细胞系与活体组织内细胞的生物特性本身就有较大差别，并不能完全代表动物体内的真实环境水平，而原代细胞被认为更能代表体内组织的情况，在某些国家/地区已经得到了法律认可（Human Tissue Act2004，UK），尤其是在药物早期的毒性评估试验时，相较于无限细胞系，使用直接从患者组织分离的原代细胞是更加合适的实验模型。

限制2

细胞系交叉污染

细胞污染？大家第一反应都是病原微生物导致了细胞实验的失败，但是我们这里说的并不是说培养体系内细菌大量繁殖影响了实验，而是细胞系之间的交叉污染。顾名思义，就是你做实验用的细胞系内可能混进了其他种类的细胞！

这个问题可能是由于建立细胞系时导致的，也有可能是一些不当操作如同期多种细胞共养、耗材重复使用等，或者是由于一些细胞培养相关产品导致的，可能很不经意的一个操作便导致了整个实验的失败。2011年美国专门颁布了细胞STR鉴定国家标准，而目前仍有很多研究者们并未意识到这个问题的严重性，但是相关机构已经开始敲响了警钟：

2014年12月和2015年2月的Science杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识的严重性，并强调污染带来的后果。不仅浪费了时间和精力，研究结论和结果不能复现，其带来的影响是十分严重的。因此NIH、ATCC等权威机构多次发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定。在 2015年4月，Nature宣布旗下所有杂志将要求作者鉴定论文中所用细胞系，同年6月即有报道称一科学家因细胞系问题，撤销了Nature论文；2017年10月发表在PLoS ONE期刊上的一篇文章发现30000多篇论文使用了HeLa细胞交叉污染的错误细胞系导致研究结果无效[1] ，2019年的研究表明，至少有24%的人源细胞系被HeLa污染了[2]。

限制3

细胞应用

很多细胞在体内体外培养中无法增殖，比如在使用神经元，骨骼肌细胞，心肌细胞，周细胞以及终末分化的肝细胞等进行实验时，每次都需要再次从新鲜的组织中分离原代细胞。

然而原代细胞最能模拟体内的生理环境，能保持一定的组织生物学特性，因此用于评估药效和毒力最为合适，同时被其他细胞系交叉污染的概率大大降低，另外肿瘤学和免疫学相关研究在制备活体动物模型时也必须要进行原代细胞的分离，但是原代细胞的培养难度远高于普通细胞系，同时，原代细胞的分离制备也一直是一个亟需解决的难题。在保证可重复性的前提下，如何高效率制备高活性的单细胞悬液样本呢？

瑞沃德单细胞悬液制备仪轻松化解这一难题，自主研发的组织处理管、酶解试剂盒和内置不同组织优化处理程序，可将组织制备成高活性单细胞悬液或组织匀浆。

使用该仪器可快速完成活性高、均一性好的单细胞悬液制备，大大增加实验可重复性。拥有独立运行的四通道，搭配加热套可提高组织处理效率。广泛应用免疫学、肿瘤学、神经生物学等研究领域。

紧接着，在原代细胞分离后要对单细胞悬液进行细胞计数和活力分析，并将细胞置于培养体系或相应的缓冲体系中。

活细胞计数的精 准度少不了外部的加持，自动细胞计数仪的使用可以对原代细胞进行精 准计数，瑞沃德C100自动细胞计数仪可配合多荧光通道，对悬液中的细胞进行定量分析，并同时显示明场及荧光图像，清晰呈现计数结果及细胞形态。适用于免疫学及疫苗开发、细胞治 疗、肿瘤研究、干细胞及代谢研究等研究领域的细胞分析。

C100自动细胞计数仪

细胞培养是原代细胞分离流程最后一步，瑞沃德二氧化碳培养箱，可精 准控制温度、二氧化碳浓度，并且是维持高湿度环境的高性能细胞培养箱。HEPA高效过滤器可有效去除空气中的微粒污染，140℃高温干热灭菌功能可实现培养箱的定期灭菌维护，为原代细胞样品提供稳定洁净的培养环境。

二氧化碳培养箱

【参考文献】

1. Serge P. J. M. Horbach， Willem Halffman. The ghosts of HeLa：How cell line misidentification contaminates the scientific literature. PLoS ONE， Published：October 12， 2017， doi：10.1371/journal.pone.0186281

2. Lin J, Chen L,Jiang W, Zhang H, Shi Y, Cai W. Rapid detection of low-level HeLa cell contamination in cell culture using nested PCR. J Cell Mol Med.2019;23(1):227–236. doi:10.1111/jcmm.13923

为什么传代后细胞存活率不佳？

为什么细胞生长不均匀？

为什么细胞生长越来越慢？

……

细胞传代作为细胞培养中的重要步骤

经常有朋友在后台追问十万个为什么

今天咱们聊聊细胞传代教你掌握传代的技巧

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1.什么是细胞传代

细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到YZ，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶，使细胞能够持续扩增。

细胞传代可以帮助我们扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

2.一般细胞传代流程&注意事项

No.1 材料准备

仪器

①离心机 ②水浴锅 ③酒精灯 ④超净工作台

溶液配制

①PBS液 ② 0.25 ％ 胰蛋白酶 ③基础培养基 ④胎牛血清

No.2 传代前准备

（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液的瓶子放入37℃温箱/洁净水浴锅内预热，用酒精棉球擦拭好后放入超净台内；

（2）75％酒精擦拭超净工作台消毒、紫外线照射30min；

（3）在超净工作台中按次序摆放好无菌的移液器、移液管、离心管、巴斯德管、培养瓶等；

（4）75%的酒精擦拭双手消毒；

（5）点燃酒精灯：注意火焰不能太小，注意酒精量不能超过瓶身的2/3。

No.3 实验步骤

（1）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞；

（2）在超净工作台内将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒，保证细胞瓶的开口朝向酒精灯方向并保持10cm距离防止明火扰乱气流杂质落入培养体系；

（3）小心吸出旧培养液，加3ml无菌PBS后盖上瓶盖，轻轻摇动细胞瓶冲洗细胞，倒弃；

（4）根据培养瓶的大小加入适量的胰蛋白酶，根据不同细胞选择不同消化条件，一般ZJ消化温度是37 ℃，但是易消化的细胞要注意消化时间避免过度消化；

（5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度（注：若细胞叠层生长可先用少量胰酶将叠层细胞消化下来，再对底层生长均匀的细胞进行正常的消化操作，正常细胞避免二次消化）；

（6）加入2倍体积的完全培养基（含血清）中止胰蛋白酶的作用，用巴斯德管/移液管/吸头等将已经消化细胞吹打成细胞悬液；

（7）将细胞悬液吸入15 ml离心管中；

（8）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000rpm/min离心5分钟；

（9）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2 ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液；

（10）分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

（11）用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱（推荐使用瑞沃德 D180-P二氧化碳培养箱）中继续培养。1.5~2小时左右开始沉降并贴附在瓶壁上。

No.4 注意事项

（1）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染；

（2）倒置显微镜下观察细胞量，必要时进行细胞计数。密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml；

（3）在每一个培养瓶做好标记，至少包括细胞名称、细胞代数、接种日期、接种人；

（4）部分传代细胞（如PC12细胞), 少量的胰蛋白酶不影响细胞的生长，故可跳过实验步骤 (7)-(9);

（5）严格的无菌操作；

（6）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

3. 常见操作问题&解答

Q:贴壁细胞传代如何使用胰酶？

A：一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，DY次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin活性降低，并可减少污染机会。

Q:如何控制胰酶消化时间？

A：胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失；消化不足细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度等有关。对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录ZJ消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

Q:贴壁细胞如何进行传代？

A：去掉原培养瓶里面的培养基，加3-4ml PBS洗1-2次；弃PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min；弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶（视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8），每瓶补足培养基至5-6ml，37℃、5%CO2孵箱培养。

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