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一、荧光基础知识

在显微成像中，荧光指的是一种光致发光现象，某些分子能吸收特定波长的光线，然后再发射出其他波长的光线的物理现象，这种分子一般称为荧光团。通常情况下，由于斯托克斯位移，荧光团的激发峰值和发射光谱之间存在差值，发射光线能量低于吸收光线，波长比激发光更长。

荧光现象有两种：自发荧光与继发荧光。自发荧光也称固有荧光，是指经照射后就能发出荧光；继发荧光也称二次荧光，物质经照射后不能或只能部分发生微弱荧光，需先用荧光染料标记处理，再经照射才能发生荧光。目前在荧光显微技术中，主要利用的是继发荧光现象。

念珠藻叶绿体的自发荧光，明美MF52-N拍摄

荧光产生包含激发和发射两个过程，在荧光显微技术中具体体现为以下几个关键部件：

（1）激发光源：主要包含以下两个指标

Ø 光源光谱覆盖发射光谱：荧光团在特定波段范围才能被大部分激发，因此激发光源的光谱范围要能匹配所观察样本中的荧光团激发特征。

Ø 发射光谱波段的强度：荧光信号一般较弱，需要使用较高亮度的激发光以产生较强信号的发射荧光信号。

（明美-四通道LED光源MG120，宽光谱 + 高光功）

（2）激发块：用于形成特异性激发/发射的一组滤光片，一般包含以下三个

Ø 激发滤光片EX：滤过光源中特定波段的光，用以激发样本中特定染料

Ø 发射滤光片EM：允许荧光团发射的特定波段的光通过

Ø 二向分色镜DM：反射激发波段的光，透过发射波段的光。透射荧光显微镜没有这个滤光片，但目前主流都是落射荧光显微镜，会有二向分光镜。

（明美可定制适配四家品牌，不同波段需求的激发块）

二、荧光显微成像的应用

荧光显微镜利用自发荧光或继发荧光现象，广泛用于生物（医学）、矿物、材料科学等领域的显微荧光观测。①在生物学领域，主要借助荧光染料标记，可准确和详细地识别细胞和亚微观细胞成分。②在矿物学领域，通常用于研究有自发荧光特性的物质，如石油、煤炭、氧化石墨烯等矿物。③在材料科学，可用于纺织工业或造纸业来分析基于纤维的材料，包括纺织品和纸张，在半导体领域，也可用来观测具有荧光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED荧光显微镜观察SBS改性沥青

（MF43-N拍摄的磁珠荧光图片）

荧光显微技术在生物学领域中应用是广泛也是复杂的，主要是对细菌、细胞、组织或小型生物（如斑马鱼等模式生物）进行标记成像，它的微观层面都是通过荧光染料对分子层面进行标记。从荧光染料的选择看，通常需要考虑几个因素，一是荧光染料标记的位置，二是该染料对应的激发特征，包括吸收光谱特征和发射光谱特征。借助荧光染料，荧光显微技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖进行染色，甚至钙离子等非生物物质也可以检测。以下根据染料结合的位置列举了一些常见的荧光染料及应用范围：

FITC荧光染色，MF52-N拍摄

（1）免疫荧光（IF）：主要标记的是蛋白质。免疫荧光技术利用抗体可以和相应抗原特异性结合的特性，主要有两种方式：一是利用内源荧光信号，即通过克隆技术用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连，如GFP等；二是利用荧光标记的抗体与目的蛋白特异性结合。

Ø FITC（异硫氰酸荧光素）：是一种有机荧光染料，495/517 nm为该染料激发/发射峰值，可以和蛋白质上的基团结合，主要用于免疫荧光和流式细胞术中。

Ø TRITC（四甲基罗丹明-5(6)-异硫氰酸）：属于罗丹明家族的衍生物，550/573 nm为该染料激发/发射峰值，可与蛋白质结合。

Ø 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特异性吸附少，消光系数高，荧光量子产率高，从而让标记显影时背景弱，信号强。除细胞显影外，它们也常用于生物筛选、蛋白免疫印迹、生物医学显影、小动物体内成像等。

Ø Alexa Fluor系列：属于带负电荷且亲水的荧光染料系列，是不同基础荧光物质的磺化形式。这些产品标识涵盖了对应的激发波长，相比于FITC等染料，具有更好的稳定性和荧光亮度。

DAPI荧光染色，MF52-N拍摄

（2）DNA染色：主要标记核酸。同蛋白质一样，对核酸进行标记与研究同样有重要意义，如对细胞核（主要成分为核酸）进行染色标记可以判断细胞的数量和位置。

Ø DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：当DAPI与双股DNA结合时，在358nm处有一个吸收峰值，在461nm处有一个发射峰值，其发射光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可与RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果。DAPI可以透过完整的细胞膜，因此被广泛用于活细胞和固定细胞的染色。

Ø Hoechst（33258、33342、34580）：这三种染料都可在350nm左右的紫外光激发，在461nm处发出蓝靛色荧光。与DAPI类似，Hoechst可透过完整细胞膜，被广泛用于活细胞和固定细胞染色。

Ø PI（碘化丙啶）：是一种不能透过细胞膜的DNA染色剂。与核酸结合后，激发波长为538 nm，发射波长为617 nm。由于该染色剂无法进入完整的细胞中，因此该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。

Fura2钙离子探针做的研究图片， 引自公开文献
Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011

（3）离子成像：研究细胞中各种离子的流动与分布对细胞活动的深入理解有重要作用。通过各种离子指示剂，如钙离子、钠离子、镁离子、锌离子等指示剂与离子结合形成荧光团，利用光谱特征检测对应离子的分布状态。

三、荧光显微成像的挑战

应用荧光显微技术进行成像的过程中，不仅要考虑成像的质量，包括分辨率、对比度、荧光信号强弱、背景光、多通道成像等，还要考虑荧光染料、光照等对样本的影响，比如荧光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了荧光显微技术应用中的常见挑战与应对方法：

汞灯需搭配带计时器的复杂控制箱来使用

（1）激发光源选择和使用。传统荧光成像使用的是高压汞灯，具有特异性的光谱特征和较高的光强，但使用有很多麻烦，首先需要预热，然后光强靠ND滤镜调节，寿命较短可能就200小时，在寿命用完前还会有光强衰减问题，需要调整ND滤镜，替换灯泡后需要重新校中。目前很多应用都用LED荧光光源取代汞灯作为荧光光源，如宽光谱大功率LED荧光光源MG-100，寿命长单个可以顶50个汞灯，光强更稳定可控，并且可以即开即用，省事省心。

明美可定制适配四家品牌的滤光片组

（2）滤光片质量和匹配度。激发块中的滤光片质量会影响激发光和发射光的透过率，影响荧光效率并带来杂散光和背景噪声问题。同时，滤光片的参数能否匹配染料的激发峰和发射峰，也会对荧光效果产生重大影响。对于简易荧光需求，明美建议使用数显荧光模块，整合光源和BGU等常用激发块，可以为四家品牌显微镜升级荧光观察，简单易用效果好。对于专业荧光需求，明美提供匹配四家品牌主流荧光显微镜的激发盒和滤光片组，可按需定制不同滤光片组合，如钙离子Fura2探针需要用U激发G发射，一般的U激发B发射滤光片组并不适合。

（MF43-N+MC50-S拍摄的小鼠脑片荧光图像）

（3）光毒性与荧光染料毒性：在生物学领域的荧光成像中，需考虑光毒性与荧光染料毒性对样本的影响，如细胞内的有机分子在与氧反应时吸收光发生分解并产生自由基，部分荧光染料本身也能产生自由基，这是引起细胞等生物样本损伤的主要来源。通常的应对思路是：①使用具有较低能量（波长较长）激发光谱的荧光染料；②尽可能低的光强和尽可能短的激发时间，需要在成像质量与样本健康之间保持平衡；③降低帧速率，尤其在长时间的荧光成像中，这种情况需要提高相机的灵敏度，保证捕获微弱的荧光信号。

（单通道荧光拍摄，经软件合成多色荧光图像）

（4）多色荧光成像：在生物学领域应用较多，尤其是在对活细胞标记成像时，需同时对多种物质进行标记，并在一个图像中显示，而大多数荧光染料具有宽发射光谱，在使用多种染料标记时会出现荧光光谱重叠现象。对于多色荧光成像，有两种应对思路，一是针对每种染料使用对应的单通道窄带滤光片，后通过软件进行合成，这种方式对成像速度及软件图像处理提出较高要求；二是使用宽光谱光源同时激发，选用双通滤光片或多通滤光片，这种滤光片的的特点是允许两种或以上波段荧光信号通过，可实现一组滤光片同时观察两种或以上荧光染料，这种方式要求相邻的发射光谱范围没有重叠，所得到的荧光信号之间能较好的被区分。

（双通滤光片荧光拍摄，镜下可同时观察到B\G两种荧光信号）

来源：https://www.mshot.com/article/1527.html

倒置荧光显微镜下的免疫荧光细胞：探索微观世界的奥秘

显微镜观察免疫荧光细胞是一种重要的实验方法，用于研究细胞内蛋白质、核酸等成分的表达、功能和相互作用，目前，免疫荧光显微镜已经成为生物学研究中不可或缺的工具之一。

在倒置荧光显微镜观察细胞时，需要选择合适的显微镜参数，以确保观察的准确性和稳定性。例如，光源的种类、显微镜的分辨率、物镜放大倍数和荧光通过率等因素。此外，在进行免疫荧光显微镜观察细胞时，需要选择合适的荧光强度和荧光颜色，以避免对观察结果的干扰。

倒置荧光显微镜MF52-N采用无限远光学设计和数显LED荧光模块，光路经过深度优化，能提供简单易用的荧光激发和高质量的相衬、荧光和明场成像，可选双光路、一体供电、人走灯灭，广泛用于细胞培养、生物制药、医疗检测等领域。

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来源：https://www.mshot.com/article/1810.html

纳米银粒子很小，才几十纳米，通常会用到电子显微镜。不过，此次，香港中文大学老师只需要观察纳米银颗粒分布，不需要清晰观察细节，同时后期需升级荧光观察，因此深圳区域工程师推荐了金相显微镜MJ43BD搭配2000万像素显微镜相机MDX10，现场演示了金相样品效果，获得用户认可。

金相显微镜MJ43，配备半复消色差的明暗场物镜和六孔转盘式落射模块，具备良好的成像质量和扩展能力，对于功能和扩展要求更高的老师很适合，标配支持明场和暗场观察，根据工业和材料学的不同应用，还能通过模块化组合，实现偏光、荧光、DIC等观察方式。

金相显微镜MJ43可应用于半导体、FPD、电路板、金属材料等制造领域，适用于教学及研究方面

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来源：https://www.mshot.com/article/1741.html

研究级荧光显微镜应用于荧光玻片观察

细胞中大部分分子不发荧光，想要观察它们，须进行荧光标记，放在培养皿内或制成荧光玻片，在荧光显微镜下进行观察、成像。目前荧光显微镜已成为各个实验室及成像平台的标配成像设备，是我们日常实验的好帮手。

荧光显微镜主要分为三大类：正置荧光显微镜（适合切片）、倒置荧光显微镜（适合活细胞，兼顾切片）、荧光体视镜（适合较大标本，如植物、斑马鱼、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。此次，明美正置荧光显微镜MF43-N安装于深圳医学检测公司，以用于荧光玻片观察。

研究级正置荧光显微镜MF43-N，配备6孔落射荧光模块和超长寿命LED荧光光源，可扩展升级实现各种观察方式，高数值孔径半复消色差物镜成像清晰，荧光成像信噪比高，应用于生物制药，医学检测、疾病预防等领域内的荧光

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来源：https://www.mshot.com/article/1707.html

倒置荧光显微镜MF52-N应用于细胞

几年来科学家正在开发细胞疗法，希望能治疗多种疾病和疑难杂症。这就需要质量控制和各种有关仪器设备来支持免疫疗法和再生医学的发展。近期，明美上海区域安装倒置荧光显微镜MF52-N，观察mcherry荧光，应用于细胞治疗。

倒置荧光显微镜MF52-N下，细胞均匀分布，生长状态良好。作为一种新兴的治疗方式，细胞治疗在众多疾病特别是癌症、遗传疾病、传染病的治疗中展现出良好的效果。而明美倒置荧光显微镜MF52-N为治疗提升效率与提高准确性。

倒置荧光显微镜MF52-N配备数显LED荧光模块，可实现三通道荧光激发，可选BGUYR等不同通道，激发光强直观可视并独立记忆，可用于细胞培养、生物制药、医疗检测等科研应用。

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来源：https://www.mshot.com/article/1716.html

文昌鱼是文昌鱼属（Branchiostoma）动物的总称， 又称蛞蝓鱼。形似小鱼，无头，两端尖细，是无脊椎动物进化至脊椎动物的过渡类型，也是研究脊索动物演化和系统发育的优良科学实验材料，具重要科学价值，一般观察这种文昌鱼采用什么显微镜观察呢？

体视显微镜下观察的文昌鱼

常规文昌鱼观察用体视显微镜较多，但个别荧光观察，还会用到体视荧光显微镜。体视显微镜采用优质光学系统设计，展现优异的分辨率及真实色彩，人机工程学设计和耐用的机身部件，长时间使用稳定可靠。是常规生物医学检验，科研研究和工业检测等高精度观察领域的理想工具。

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【本文的标题和网址】文昌鱼一般用什么显微镜观察？；http://www.mshot.com/article/868.html