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在上期“单分子成像：实话讲，sCMOS真心倍儿香!”文章的末尾，我们提到了“双色成像”这个话题。关于在显微成像中，什么样的实验需要用到双色成像，这里就不赘述了。而对于这类应用来讲，均需尽可能地将两个不同颜色荧光信号，在同一时刻拍摄下来。这就是我们接下来要说的“双色同步成像”，即完全同时地拍摄两个颜色通道的荧光信号。

实现这样的成像，最直接的思路，是在原本黑白的相机芯片基础上，将每个像素前添加滤光涂层（一般为红、绿、蓝三种）；又或者采用滤光块转盘或采用滤光轮，来进行不同颜色之间的切换。

滤光涂层：会吸收或反射部分入射光信号，影响成像信噪比；其次，由于不同像素前存在不同颜色的滤光涂层，对于单色光信号（如荧光信号）的实际分辨率将被降低。

滤光块转盘或滤光轮：无法做到完全同步拍摄两个颜色的图片，影响实验的时间分辨率，造成数据误差。

而一个名为“W-VIEW GEMINI”的双色分光器，则可以wan美地解决所有问题，实现方便、快捷、高质量的双色，甚至是三色、四色的完全同步成像。下面我们就来看看以它搭配单相机，以及双相机的两套具体解决方案吧！【前方大量实例预警】

单相机方案

一台相机也可以实现双色同步成像

滨松W-VIEW GEMINI双色分光器可将成像信号按照颜色进行分光，配合高速高灵敏度的滨松ORCA-Flash4.0系列sCMOS相机，以及其专门开发的W-VIEW读出模式（可成像于同一台相机芯片两边），构成一套使用极其灵活的双色同步成像解决方案。

我们先来划出这套方案的3个ZD：

· 双色分光器可随意更换滤光片，使用灵活方便；

· ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机具备W-VIEW读出模式，使用灵活方便+1；

· ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机，保证了极高速的成像能力。

随意更换滤光片

W-VIEW GEMINI允许使用者自行更换其中的滤光片以灵活适应于各种颜色/波长之间的分光需求。其中的滤光片尺寸为显微镜中常用的标准尺寸，zui大限度地方便研究者对于滤光片的挑选使用。

关注滨松微信公众号，回复“双色成像0907”可获得W-VIEW GEMINI介绍视频。不仅包含更换滤光片的操作，而且包含分光模式/By-pass模式切换操作以及光路校正操作的介绍演示。

W-VIEW读出模式

ORCA-Flash4.0系列sCMOS相机具备W-VIEW读出模式，W-VIEW GEMINI可以将两种颜色的信号成像到一台相机的一个感光芯片上，可以分别调整同一芯片上下两半的曝光时间。

所以在采用W-VIEW GEMINI配合ORCA-Flash 4.0系列sCMOS相机的时候，就可以非常灵活地调整两个颜色信号的相对亮度，得到更加能够突出所需信号和结构的图片。在两个颜色通道的信号差别非常大的时候，这种灵活的曝光时间设置，就可以针对不同的波长设置不同的曝光时间，同时保证两个波长信号的信噪比。

高速双色同步成像

ORCA-Flash4.0是滨松sCMOS相机的一个经典系列，以高性能圈粉无数。接下来，我们就来看看它与W-VIEW GEMINI的双色同步成像方案的实际案例吧。

作者在300-500帧/秒单层光片(lightsheet)成像的基础上，实现了针对斑马鱼心脏的3D高速光片双色成像。滨松的双色同步成像方案被用于这一套“high-speed SPIM”系统中。

对于高速高灵敏度的Flash 4.0 sCMOS相机，作者也在文章中专门提到："… Ourdata demonstrate that the high acquisition speed of SPIM with modern sCMOScameras (400 fps for 512 × 512 pixels) is key for optimal 3D reconstructions ofthe beating heart."

斑马鱼尾部血管中的部分血细胞被标记了绿色的荧光。为了区分清楚同时处于高速运动状态的被标记细胞和普通细胞，以及看清楚其具体的行为，我们不仅需要高速采像，而且需要完全同步地拍摄到样品荧光和明场的图像；否则对于这样高速运动的样品，先拍一张明场再拍一张荧光就很难做到细胞的一一对应。

为达到这些要求，实验采用红光进行明场的拍摄，这样W-VIEW GEMINI双色分光器就可以将红色的明场信号及绿色的荧光信号分光并成像到相机芯片的两边（参见下右的光路示意图），实现完全同步地荧光和明场成像。

双相机方案

多色同步成像

滨松W-VIEW GEMINI-2C同样是一个双色分光器，能够将成像信号按照颜色进行分光并成像于两台相机上。2C的设计初衷，是为了方便需要双色同步的尖 端成像应用的开发与研究。所以在超分辨级别光学质量的基础上，2C还具有较好的灵活性。

同样，我们来划3个ZD：

· 可随意更换滤光片；

· 可针对光瞳面（Pupil Plane）进行各种操作与观察；

· 可扩展为3色、4色的同步成像。

随意更换滤光片

 W-VIEW GEMINI-2C允许使用者自行更换其中的滤光片以灵活适应于各种颜色/波长之间的分光需求。其中的滤光片尺寸为显微镜中常用的标准尺寸，且在滤光片厚度上有着更大的灵活性，zui大限度地方便研究者对于滤光片的挑选使用。

针对光瞳面（Pupil Plane）的操作

W-VIEW GEMINI-2C采用了模块化的设计，在基础配置之外，也为使用者提供了各种附件选项以满足各类需求。其中对于光瞳面（Pupil Plane）的操作需求我们可以提供3类附件:

（1）三轴支架附件（triaxialholder，A12802-12）：此附件辅助使用者将所需的光学元件（直径25.4mm，厚度不超过5mm）安装在光路中的光瞳面上并允许进行位置调整，其中xy轴的调整范围为1mm，z轴为2.5mm。

（2）勃氏镜附件（BertrandLens Unit，A12802-13）：安装之后允许对光瞳面/后焦面进行成像，方便光路的校正与调整。

（3）透镜附件（Field LensUnit，A12802-20，21）：此附件为透镜支架，主要用于调整光瞳面的位置，使用者可以根据前端光路（如显微镜光路）的特征自行选择合适的透镜进行安装。

如上所述，三轴支架附件（A12802-12）可以帮助将任意光学元件放置于光瞳面，为W- VIEW GEMINI-2C的应用提供了许多的可扩展空间。例如我们可以在光瞳面中引入phase mask（由Double Helix提供）以调整光路的点扩散函数（PSF），从而得到将z轴的信息，方便3D双色的高速成像。

多色同步成像的扩展

W-VIEW GEMINI-2C可以将成像信号按照颜色分为两路。如果将两台联用，或与两个W-VIEW GEMINI联用，则可以分别达到3相机3色同步成像、或双相机4色同步成像的要求。

方便光路矫正

在灵活的同时，W- VIEW GEMINI-2C的设计也着重考虑了光路校正的便利。为了让两个通道图像的重合度达到设计值（不重合度低于一个像素），在W-VIEW GEMINI-2C上不仅提供了轴向色差校正旋钮、相机接口旋转校正旋钮以及xy平移校正反射镜，而且提供焦距校正附件（ZOOM Correction Lens Unit，A12802-11）以及可以放置于成像共轭面中的网格附件（Grid Chart Unit，A12802-14）以方便精细的校正。

MICA

研究人员在活细胞成像技术的帮助下，可以深入了解活细胞甚至完整生物体的动态过程，这包括细胞内和细胞外活动。一些代表性的示例包括蛋白质或脂质转运、免疫细胞迁移，类器官的组织结构等。活细胞成像要求样本和显微镜系统具备特定的属性。在这篇文章中，我们描述了MICA如何解决活细胞成像的问题，并提供了合适的示例。

活细胞成像

活细胞成像在微观层面揭示了生物体变化的全过程。它要求将样本保存在接近生理的条件下。我们会在后面重 点介绍到。典型的样本包括活细胞培养、活组织、类器官或模式生物，通常会使用荧光显微镜研究这类样本。为此需要转染细胞，从而产生表达荧光标记蛋白质的转基因体。此外，还可以使用活细胞染料。

挑战

环境条件

为尽可能获得接近真实状态的实验结果，活细胞成像条件必须模拟生理环境。不同的生物体所需的生理条件也不同，包括温度、pH、氧气含量等。例如，哺乳动物细胞要求的温度是37°C左右，昆虫细胞的最 佳温度是27°C，鱼为28°C，而裂殖酵母则为30°C左右。

在碳酸氢钠缓冲液的帮助下，细胞培养基内的pH值持续保持在7.0-7.4，这就要求培养箱环境中相应地存在二氧化碳。此外，培养箱的环境应该是水饱和的，这样就不会有培养基蒸发了。

体内不同组织和细胞的所需氧含量是不同。目前细胞培养箱和活细胞成像并没有广泛考虑氧的问题。不理想的氧气水平会导致增殖率下降（高氧）或代谢率降低（低氧）（Hadanny, A.; Efrati, S.）。

光保护是活细胞成像的另一个挑战，因为光照射可以影响活细胞本身以及荧光团。例如，强光可以导致DNA损伤或光漂白荧光团。

MICA的设计旨在应对所有这些挑战

外壳本身就像一个培养箱。这意味着样本周围空间被加热到所需的温度（比室温高5°C，最 高42°C），并平衡到所需的二氧化碳浓度和湿度。

如果需要的话，氧气浓度可以进行调节。所有的参数均可通过MICA LAS X软件控制。样本的光照射条件由OneTouch功能设置，并可通过“Sample Protection – Image Quality”滑块进行调整，以平衡所需的信号量与保护活细胞和荧光团。

为了在最 小的环境干扰下获取样本，在前门中隐藏有一个小的服务挡板。

图1：MICA是一个培养箱。盖子下面的整个空间可以被平衡到所需的温度、湿度和二氧化碳浓度。为了快速检查样本或操作，前盖可以折叠下来，一个小的服务挡板可以滑开。

光可能是有毒的

由于光对样本有负面的影响，任何光都可能干扰细胞内的分子，例如紫外线可能伤害皮肤。此外，荧光团可能形成与分子相互作用的自由基。光的负面作用被称为光毒性。挑战在于激发产生足够的信号来解答科学问题的光强与尽量减少光毒性的平衡。MICA通过提供一个工具来帮助用户在不需要了解技术背景的情况下精确地平衡这两件事——“Sample Protection – Image Quality”滑块。只需点击一下，OneTouch将根据滑块上的选择设置所有的激发和检测参数。

细胞内的动态变化可能非常快。例如，细胞器或囊泡分子的运动速度可达几微米/秒（Alberts B.等人）。这极大程度的考验了对图像采集的要求，特别是当需要对多个荧光团进行成像时。这里的问题是，生物不会暂停所有的荧光通道从而在相同的状态下进行采集，而是持续不断进行。在一个经典的基于荧光滤片的系统中，通常最耗时的步骤是为不同的通道更换滤光片。这导致实验中两个荧光团在两个不同的时间点被监测，导致无法实现精确的时空相关性。

MICA FluoSync™技术使用户能够同时获得多达四个荧光通道。这意味着不同的囊泡、细胞骨架和运动蛋白可以以100%的时空相关性进行成像。此外，同步采集使成像时间点的节奏更快，因此，可以用更灵敏地记录快速的细胞运动。

在给定的时间范围内记录更多的时间点信息

在一个实验中记录更多的时间点信息可能是一个挑战。假设用户想每10分钟记录一次，那么在下一个周期开始之前，只能记录一定数量的位置。通常情况下，如果您想在同一位置记录多个标签，就会有更多限制，但MICA不存在这个问题。FluoSync™技术使用户能够以四倍的速度记录，因为它最 多可以同时获取四个标签，从而为用户留下更多的时间来记录更多位置。用户不必再在标签数量和位置之间进行权衡。

寻找正确的位置进行成像

寻找正确的样本位置和设置实验是具有挑战性的。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。一些显微镜可以生成样本的预览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低放大倍数或高放大倍数的预览，轻松定位感兴趣的区域，这些感兴趣区域可以用工具直接在图像上标记出。通过这种方式，后续高分辨率的图像可以保存下来。

选择正确的活细胞成像物镜

由于活细胞成像通常是在水溶液中进行的，高倍率物镜通常使用水作为浸没介质，因为它与培养基介质的光学特性相匹配。将水手动放在物镜和样品之间是很麻烦的，而且会导致样本的焦点和位置的改变。此外，水蒸发得相当快，需要不断补充。MICA集反馈回路于一体，在水浸式物镜的整个使用过程中，首先建立并维持浸没状态。这种方法不需要手动操作，可以进行长期实验。

为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本平板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

重复实验之间的可比性

科学实验的一个关键方面是，尽可能少的变更可变参数以实现对样品和结果影响的把控。这包括在所有的实验中应用同一套成像条件。一个方面是稳定的环境条件（温度、pH值和O2，见上文）。另一个重要方面是相同的成像参数（激发和检测）。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像恢复成像参数。在环境条件方面，MICA是一个培养箱。MICA条件稳定能允许MDCK囊肿连续生长3周（见下文）。

方法

MICA有用于活细胞成像的特殊的样本夹。这包括用于小型（36毫米）和中型（60毫米）培养皿的支架。

图2：活细胞成像样本架。有适用于不同尺寸的培养皿的支架。活细胞成像也可以使用经典的载玻片支架（未显示），例如，使用ibidi µ-Slide 8 Well载玻片支架。

囊泡

U2OS细胞同时用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555进行染色。这两种染料都聚集在细胞的质膜和所有囊泡和内体上。荧光剂同时或序列成像以进行比较。环境被设定为37℃恒温和5%CO2，即生理pH水平。

对于高倍率成像，使用了带有自动加水功能的63x/1.20水镜。

斑马鱼

发育中的胚胎从球期到体期的全过程。图像中的鱼（斑马鱼）是一个中胚层带有报告基因的转基因鱼（Tbxta：GFP），Dextran-Alexa647标记间质。胚胎保持在28℃。

囊肿

a) 将稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在基质Matrigel中培养，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上诱导囊肿生长。环境被设定为保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高湿度。

在第2天，细胞已经显示出三维聚团，并在基质Matrigel内高度流动。

在第9天，囊肿保持生长相对稳定，并用较高的放大率（63倍）进行成像。采集6天的时间序列（6小时的时间间隔的GFP和IMC（明场成像的调制对比））。三维采集能获得囊肿的三维图像（418层，220.7纳米间距，总Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，囊肿除了EB1-GFP标记之外，还被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555标记。

b) 5000个稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在U型孔板中生长。有趣的是，这些细胞在几天后也形成了囊状结构。其中一个囊状结构在共聚焦模式下被进一步研究，以进行三维重建。

结果

短期的快速事件实验

U2OS细胞用两种不同的荧光染料标记相同的结构，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它们都与细胞膜结合。通过在MICA序列模式下，这个实验设置能够在获取WGA-Alexa488（绿色）和WGA-Alexa555（红色）之间引入一个人为的时间差。有了MICA同时成像技术，两种不同的Alexa染料标记同样的膜结构，能够在最 小时间差的两个时间点成像。你可以在两种方法的比较中看到，在同步扫描中所有的囊泡都是黄色的——即绿色和红色的混合物，而在序列扫描中一些快速移动的囊泡看起来是两种不同的结构——即一个绿色和一个红色的囊泡。

中时程实验

斑马鱼是一种模式生物，经常用于发育研究。在这个例子中，我们感兴趣的是研究细胞在空间的协调性，而这种协调性受到周围组织的粘度的影响。在THUNDER模式下对两个通道进行了24小时的成像，并使用LVCC以获得更多的细节。 

长时程实验

MDCK细胞是极化的上皮细胞，如果在Matrigel这样的基质上培养，会成熟为所谓的囊肿。这些三维结构可用于研究发育过程和潜在的蛋白质运输机制。这里，细胞被稳定地转染了与GFP相连的微管结合蛋白，并在MICA中培养了3周。

图3：MDCK囊肿。3周的活细胞实验。时间间隔为6小时。扩展景深（EDOF）。上图：通道叠加。中图：EB1-GFP。下图：明场。THUNDER  LVCC技术。比例尺为20μm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

发育9天后，用活细胞染料对上述一些囊肿进行了染色，以观察肌动蛋白、微管蛋白和线粒体，GFP标记的微管结合蛋白，在共聚焦模式下对囊肿进行了成像。

图4：第9天的MDCK囊肿（CLSM）。除EB1-GFP(绿色)外，部分囊肿用Mitto - blue(品红色)、SiR-Actin(红色)和Tubulin-SPY555(黄色)染色，并用63x/1.20物镜在共聚焦模式下成像。比例尺 = 20 µm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

在U型孔板中培养细胞也可形成囊状结构。本实验中，MDCK细胞从第1天开始在MICA上培养并在明场和宽场荧光模式下记录，以研究囊肿的形成。MICA培养箱的特性使细胞在发展成囊状结构的过程中保持良好的状态。

培养14天后，在低倍镜共聚焦模式对囊肿进行成像，以确定一个感兴趣的囊肿。96孔板筛选样本以寻找合适位置来做进一步研究可能是很麻烦的。Navigator工具在此帮助实现样本的预览，并轻松地导航到相关的感兴趣的区域。

图5：用10x/0.32物镜和GFP通道对第14天的囊肿进行预览（CLSM）。

然后用63x物镜在LIGHTNING共聚焦模式下对其中一个囊肿进行了更细节的成像。63x/1.20水镜的加水是自动建立，并通过自动校正环对样品进行了优化。视频5显示了共聚焦和LIGHTNING的成像效果。

结 论

MICA适用于快速、短期到几周的长期活细胞成像实验，帮助用户获得可靠的结果。集成的培养系统在温度和pH值方面提供了接近生理的条件，使活细胞成像可以持续数周。另外，可以控制氧气水平，以获得更高的重要数据。FluoSync™技术可以同时对多达四个荧光团进行成像，这意味着可以对快速发生的细胞事件进行绝 对的时空相关性成像。此外，FluoSync™缩短了记录多色图像之间的间隔，从而提高了时间分辨率。THUNDER和LIGHTNING帮助用户从样本中提取更多的细节，借助OneTouch的照明和自动补水的流程，即使是仅接受少量培训和有限技术背景的人员都可以轻松使用。

参考资料

·Making Long-term Time-lapse Microscopy More Efficient, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

·Hadanny, A.; Efrati, S. The Hyperoxic-Hypoxic Paradox. Biomolecules 2020, 10, 958.

·Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Molecular Motors.

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