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关于实时荧光定量PCR技术，最常见的应用是通过RT-qPCR进行基因表达分析、疾病诊断和管理（如病毒定量）、食品检测（如转基因或过敏原分析）以及动物或植物育种等研究。这种方法非常灵敏，因此为了得到可靠的实验数据，避免错误是十分重要的。RT和qPCR数据评估的整个工作流程包括以下几点：

1、实验设计

2、样品的制备和提取/纯化

3、RT和qPCR

4、数据评估

在以上过程中，实验人员有可能因为操作错误或失误导致实验数据的失真。但往往有些错误的来源又十分不明确，所以排除故障的第一步是需要再次检查实验流程并重复实验。

实验设计

RT或qPCR反应的第一个重要步骤是测定PCR产物及验证相应的引物和探针。实时RT-qPCR引物和探针最有效的设计是使用引物设计软件，大多数软件都可以调整设置参数的最佳属性，以检索到符合要求的引物探针序列。这些设置参数考虑熔化温度Tm、互补性、二级结构以及扩增子大小和其他重要因素。同时建议跨内含子设计引物，避免来自gDNA的干扰，直接得到cDNA片段。对于基因特异性引物的设计，应满足以下标准：

扩增子大小: 75-200 bp

引物长度: 18-30 bp

GC 含量: 40-60%

解链温度: 55-60℃

3' 端: 1-2 G or C，以具有良好的稳定性

不超过3个G or C （可能不匹配）

没有二级结构，重复序列或回文结构

浓度: 150-200 nM

样品的制备和提取/纯化

模板的质量直接影响到检测性能，在qPCR结果的故障排除过程中也需要考虑。首先，组织取样和保存是实验可变性的第一个潜在来源。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率，降低产量；部分降解的RNA可能不能给出准确的基因表达结果。核酸应从新鲜或立即冷冻的组织中提取和纯化；同时建议使用生物学重复（至少3个）。RNA或DNA的分离是PCR实验前的关键步骤。这是必要的，以便提取对所有样本都是有效的，并得到纯化的核酸（DNA，RNA）。可采用高分辨率琼脂糖凝胶检测核酸质量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）检测核酸纯度。

另外也要注意，用于PCR制备的工作空间所有台面及物品都应进行常规去污，以防止交叉污染。

逆转录和实时荧光定量PCR

RT-qPCR是一种分析DNA或RNA的高灵敏性工具。当PCR扩增靶标时，错误同时被放大。可以通过标准化和尽量减少移液步骤来减少PCR反应中的技术错误；在无灰尘的干净环境中建立反应；通过对无模板（水）对照进行PCR反应，常规检查引物和试剂库存的DNA污染等。

在进行qPCR时可能会出现以下故障：没有扩增、qPCR效率多大或过小、Cq值过大、重复性差、扩增曲线异常、非特异性扩增等等。

运行后的数据分析-基线和阈值的设置

基线校正是去除背景荧光的必要条件。可能的原因是qPCR设备的检测器噪音，或是不同的样品量或染料（探针或插入染料）的残留荧光。所有样本的基线起点一般从0~3个循环开始进行量化，基线终点是在各个扩增曲线起峰位置前的1~2个循环。为了使实时RT-qPCR数据有意义，应在扩增曲线的指数扩增阶段设置阈值，阈值自动设置一般是基线期荧光信号标准偏差的10倍。

Cielo™实时荧光定量PCR系统

Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您提供3/6检测通道，根据实验需求灵活配置。这款产品采用高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

前言

聚合酶链式反应（PCR）是用于扩增特定DNA片段的分子生物学实验技术。实时荧光定量PCR（以下简称qPCR）作为第二代PCR技术，自1996年推出以来，已经广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、动植物育种等许多研究领域，为了获得最理想的检测结果，qPCR从样本采集、核酸提取、cDNA合成到上机检测的流程有许多可以优化的参数。

qPCR实验的工作流程首先需要确定研究的目的，根据实验设计规划好实验分组、重复次数等细节。接下来分为样本准备和引物探针验证两个重要的步骤。样本准备主要是核酸提取逆转录等步骤，引物探针需要去测试特异性和效率。接下来需要使用qPCR仪来对样品中的目的核酸进行扩增qPCR结束后根据实验目的对目的核酸进行相对或者绝对定量。接下来讲的qPCR体系优化会围绕着这个流程展开。

1.样本的采集与处理

首先，提前做好功课，了解样本的不同分型，或者了解详细的细胞分群。如果条件允许尽可能覆盖所有的组织类型或者细胞类型。其次，尽可能增加样本数量，也就是生物学重复，从而更客观地反映生物变异程度。另外，qPCR实验也需要有技术重复来降低误差。

采样是需要严格规划的过程，比如材料的时效性、珍贵程度等，都要纳入考量范围。样品要尽量新鲜，取样尽可能快速。戴手套操作，防止污染。如果不马上提取核酸，需要-80°C保存，并尽快处理。

2.核酸的提取和检测

模板的质量直接影响到检测性能。核酸提取需要有效地将RNA或DNA从其他混合物中分离。RNA样本中的污染物——基因组DNA、DNA结合蛋白、酚类化合物或在提取RNA过程中引入的外源杂质(如手套中的粉末)——都已被证明会抑制下游实验，如逆转录和PCR扩增。核酸提取需要使用无菌无酶的试剂耗材，避免RNase或DNase污染，并对内源RNAse或DNAse进行有效抑制；多糖多酚样品要考虑多糖多酚杂质的有效去除。低温保存防止RNA或DNA降解。

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率，降低产量。部分降解的RNA可能不能给出准确的基因表达结果。对于基因的定量，必须使用高质量的RNA，这意味着需要非常仔细地检查RNA的浓度和质量。可采用高分辨率琼脂糖凝胶检测核酸质量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）检测核酸纯度和浓度。

3.cDNA合成

RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要影响。并且RNA 很脆弱，容易降解。为了保证 RNA 的完整性，我们需要非常注意，比如在冰上操作，用 RNase-free 的枪头和离心管，减少操作时间等。在反应体系中加入 RNase 抑制剂也能有效防止 RNA 降解。

如何评价样品中的杂质对逆转录的影响呢？可以梯度稀释后绘制标准曲线，如果低浓度的样品点数值偏大比较明显，基本可以判定杂质影响显著。

不同厂家的反转录试剂会有差异，对RNA中的杂质耐受程度也不同。逆转录酶在整个反转录体系中具有关键性影响。除了活性以外，逆转录酶的热稳定性同样很重要，在较高温度下进行逆转录，能够减少 RNA 的二级结构，增加逆转录的效率。

除了掌握 RNA 的完整性之外，反转录之前还需要对 RNA 浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求，建议 total RNA 上样量小于 5 μg。超过这个范围，会使反转录产物产生偏好性 (表达丰度高的基因优先被反转录) 而造成定量结果不准确。

逆转录出来的cDNA可以直接放在4°C保存，若长期不用，可分装，然后-20°C保存。

4.qPCR方法的建立

① 定量方法

绝对定量：检测起始模板数的精确拷贝数，需要标准品构建标准曲线。

标准品可以是纯化的基因组DNA、质粒DNA或者体外转录RNA(cDNA)，其作用是生成标准曲线，建立Ct值与浓度之间的线性关系。

标准品与待测样品的PCR效率一致，且接近100%，与样品的性质尽可能接近，与样品相同的扩增条件（PCR体系、耗材、同一次扩增），大于或等于5个梯度稀释的标准品。

相对定量：在一个样本中，目的基因相对于内参基因的量的变化。

内参基因选择建议筛选不少于三个内参基因来归一化RT-qPCR数据。目的是消除外部样品偏差，例如总RNA含量，RNA稳定性，酶效率或样品装载量的变化。

对候选的内参基因进行qPCR 实验，得出Ct平均值以及 Ct值的标准偏差，选择SD最小的基因作为实验内参。可通过geNorm 、 BestKeeper  、 NormFinder、RefGenes 等工具来评估您的内参基因。

② 荧光标记方法

染料法：利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量。

TaqMan荧光探针：是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; PCR扩增时, Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。

引物探针设计可以参考Gene π网站.

③  引物扩增效率验证

标准曲线是评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法，该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。最常用的是10倍梯度稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值，最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线，得到线性方程Cq= -klgX0+b，扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。

④  反应体系优化

▶  根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂。

▶ 每对引物先进行预实验，确定特异性以及最适浓度。

▶  配置不同的PCR反应体系，选择每个组分合适的浓度。

▶  设置温度梯度测试引物最合适的退火温度。

▶  实验设置NTC、NRT、 NEG和POS等对照组，来监控实验体系或污染。

实时荧光定量PCR常见问题分析

1.可疑的扩增曲线

真正的扩增曲线，有特征的形状：首先背景信号，然后是三个增长阶段（指数增长期、线性增长期和平台期）。

如果不是同时具有特征性的三个增长阶段，没有典型的指数增长期，那就不存在扩增。

平台期很低也是常见的异常扩增曲线。可能是模板的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系中会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。这种情况可通过调整引物和模板的比例。

2.异常的荧光信号

NTC出现荧光信号---引物二聚体形成或气溶胶污染，查看熔解曲线是否为单一峰。

3.扩增效率过高或过低

过低的扩增效率（<90％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物设计不好或扩增子具有二级结构。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  Taq酶无活性或活性降低。

▶  样品抑制。

过高的扩增效率（> 110％）可能存在的原因：

▶  移液器校准不良或移液技术差。

▶ 不正确的稀释导致标准曲线出现错误。

▶  引物二聚体或非特异性扩增。

▶  标准曲线动态范围太小。

▶  基因组DNA污染。

4.重复性差

为精确定量，对每个样品都要做重复实验，复孔之间的Ct值不应超过0.5，标准偏差不大于0.2，这样，实验结果就有很好的精确度。

造成重复性差的原因：

▶  加样误差（操作或者加样器导致）。

▶ 没有将试剂和样品充分混匀。

▶  低拷贝的目的片段→泊松分布。

▶  基线阈值设定不合理。

Cielo™实时荧光定量PCR系统

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