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  heitiansh1 2017-10-09 00:00:00

  一、针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素） 100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（YZRNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液65℃预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙 醇），－20C下沉淀。 7、以2000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于 100ml 水中。 二、较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤： 1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。 2、取1.5ml 培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul 的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入 30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl 充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl 溶液，混匀 后再65℃温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中， 加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml 的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 三、菌液直接PCR 菌液直接PCR只需要用枪头沾取菌落，或者加入1-2微升菌液即可。预变性时间可稍微延长。如果引物特异性好，效果与用DNA模板差不多。

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