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冷冻干燥技术是将含水物料预先冻结后在真空状态下进行升华而获得干燥物料的方法，干燥后物料原有的化学、生物特性基本不变，易于长期保存，是一种优良的干燥方法，被广泛应用于食品、生物制品、医药、化工、材料制备等各个领域。而在冷冻干燥过程中，物料的共晶点和共熔点是冻干工艺中重要的2个参数。物料的共晶点是指物料中的水分全部冻结时的温度。物料的共熔点是指完全冻结的物料，当温度升至某一值时，物料内部的冰晶开始熔化时的温度。由于冷冻干燥是在真空状态下进行，只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成冻干产品鼓泡，因此冻干产品升华时物料预冻温度要低于物料共晶点5～10℃，保证物料完全冻结，同时在干燥时加热温度不能高于物料的共熔点，否则在物料内部将会产生气泡或充气膨胀，出现融化和干缩现象，影响冻干制品的质量。

北京四环福瑞冻干技术适用于液态物料的共晶点和共熔点测试。

一、共熔点测试

需要冻干的产品，一般是预先配制成水的溶液或悬浊液，因此它的冰点与水就不相同了，水在0℃时结冰，而海水却要在低于0℃的温度才结冰，因为海水也是多种物质的水溶液。实验指出溶液的冰点将低于溶媒的冰点。
   另外，溶液的结冰过程与纯液体也不一样，纯液体如水在0℃时结冰，水的温度并不下降，直到全部水结冰之后温度才下降，这说明纯液体有一个固定的结冰点。而溶液却不一样，它不是在某一固定温度完全凝结成固体，而是在某一温度时，晶体开始析出，随着温度的下降，晶体的数量不断增加，直到Z后，溶液才全部凝结。这样，溶液并不是在某一固定温度时凝结。而是在某一温度范围内凝结，当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点。而溶液全部凝结的温度叫做溶液的凝固点。因为凝固点就是融化的开始点（既熔点），对于溶液来说也就是溶质和溶媒共同熔化的点，所以又叫做共熔点。共熔点才是溶液真正全部凝成固体的温度。
    共熔点的概念对于冷冻干燥是重要的，因为冻干产品可能有盐类、糖类、明胶、蛋白质、血球、组织、病毒、细菌等等的物质。由于冷冻干燥是在真空状态下进行，只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成液体的浓缩使冻干产品的体积缩小；而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来，造成象液体沸腾的样子，使冻干产品鼓泡，甚至冒出瓶外。为此冻干产品在升华开始时必须要冷到共熔点以下的温度，使冻干产品真正全部冻结。
二、共晶点测试

共晶点是指物料中水分完全冻结成冰晶时的温度。在升华过程中，物料温度应维持在低于而又接近共融点的温度。也指物料中游离水分完全冻结成冰晶时的温度。在溶液的冻干过程中，非常有必要知道溶液的共晶点，因为这将有助于控制预冻和升华过程。在真空冷冻干燥过程中Z关键的条件就是控制物料温度保持在共晶点温度以下10-15℃，从而保证物料不熔化，维持微孔结构和理化性质保持完好不变。

在冻干过程中，物料预冻的Z终温度以其共晶点为依据，干燥加热时物料的温度以其共熔点为依据。物料的共晶点是指物料中的水分全部冻结时的温度。为保证物料完全冻结，预冻温度要比物料的共晶点低5-10℃。若预冻温度过低，则增加能耗和生产成本；若预冻温度高于共晶点，则不能保证物料中的水分完全冻结，物料内部水分将不能完全以冰的形式升华，导致物料在干燥过程中发生收缩和失形等问题。另外，未冻结的水分中所含溶质，在干燥过程中可能随内部水分向物料表面迁移，出现冻干制品表面硬化现象。物料共熔点是指完全冻结的物料，当温度升至某一值时，物料内部的冰晶开始熔化时的温度。干燥时加热温度不能高于物料的共熔点，否则在物料内部将会产生气泡或充气膨胀，影响冻干制品的质量。

常规测定共晶点/共熔点的方法是电阻法，故准确地测定物料的共晶点与共熔点，对冷冻干燥工艺的制定和冻干过程的优化控制就显得尤为重要。

三、测试仪的主要特点

1. 智能化自动判断物料共晶点和共熔点。

2. 采用两行式液晶显示屏，直接显示物料的共晶点和共熔点。

3. 实时显示当前物料温度。

4. 性能稳定、可靠，操作简单。

四、使用条件

1. 正常工作条件：环境温度：5℃～30℃

相对湿度≤85%

电源电压：AC（220V±22）V  （50±1）Hz

工作环境应通风良好，没有导电尘埃、爆炸性、腐蚀性气体及强电磁场干扰。

2. 运输贮存条件：环境温度：≤30℃

相对湿度：≤85%

贮存环境应通风良好，无腐蚀性气体。

五、操作步骤

1、共熔点测量法

1）将一对白金电极浸入液体产品之中，并在产品中插一温度计，把它们冷却到-40℃以下的低温，然后将冻结产品慢慢升温。

2）用惠斯顿电桥来测量其电阻，当发生电阻突然降低时，这时的温度即为产品的共熔点。电桥要用交流电供电，因为直流电会发生电解作用，整个过程由仪表记录。

2、共晶点测试仪测量方法

1）将待测试的物料装入西林瓶中，调节支架高度，使共晶点测试仪的探头能浸入物料液面下，再锁紧调节螺钉。

2）将测试仪探头、支架以及装有物料的西林瓶放入冻干机内，关闭冻干机门。

3）将共晶点测试仪的电源插头连接上220V交流电源插座中。

4）打开电源开关，共晶点测试仪即自动进入共晶点共熔点测定程序。此时开启冻干机进行相应冷冻与加热操作即可。

冻干保护剂

  在冷冻干燥的液体制品中，除了那些有活性、有生命或有治LX果的组分之外，统称为冻干保护剂。它不同于佐剂，佐剂具有治LX果，而保护剂则无治LX果。

  有些液体制品能单独地进行冷冻干燥，但也有些液体制品进行冷冻干燥往往不易成功。为了使某些制品能成功地进行冷冻干燥，改善冻干产品的溶解性和稳定性，或使冻干产品有美观的外形，需要在制品中加入一些附加物质，它们就是保护剂，有时也称保护剂为悬浮介质、填充剂、赋形剂、缓冲剂、基础物等。保护剂对于冻干制品必须是化学惰性的。

保护剂有以下作用:

1、细菌和病毒需要在特定的培养介质中生长繁殖，但这些培养介质与细菌和病毒往往难以分离，他们一般能成功地冷冻干燥在这些培养介质中。例如肉汤、脱脂乳、蛋白质等。

2、有些活性物质浓度极小，干物质含量极小，在冷冻干燥时已经干燥的物质会被升华的气流带走。为了改善浓度，增加干物质含量，使冻干后的产品能形成较理想的团块，因此需要加入填充物质，使固体物质的浓度在4—25%之间，这些填充物或赋形剂是蔗糖、乳糖、脱脂乳、蛋白质及水解物、聚乙烯毗咯烷酮(PVP)、葡聚糖、山梨醇等。

3、有些活性物质特别脆弱，在冷冻和干燥时由于物理或化学原因会受到危害，因此需加

入一些保护剂，以减少在冷冻和干燥时的损害，例如加入二甲基亚矶、甘油、右旋糖昔(葡聚糖)、糖类、聚乙烯毗―咯烷酮等。

4、加入某些物质可以提高产品的崩解温度，以得到良好的产品，并容易冻干，它们是甘露醇、甘氨酸、右旋糖昔、木糖醇、聚乙烯毗咯烷酮等。

5、为了改变冻干液体制剂的酸碱度，从而改变共熔点以利于冻干，它们是氢氧化钠、碳酸氢钠等。

6、为了改变产钻贮藏的稳定性，提高贮藏温度，增加贮藏时间，它们是抗氧化剂类，例如维生索C、维生索E、氨基酸、硫代硫酸钠、硫腺等。

保护剂的范围相为宽广，品种繁多，但找不到十分理想的保护剂，对于不同的冻干制品也没有一个保护剂的通用配方，每种产晶的适宜保护剂需通过反复的试验才能确定。

从保护剂的组成不同可分为下列几类:

1、复合物:脱脂乳、明胶、蛋白质及水解物、多肽、酵母、肉汤、糊精、甲基纤维素、血清、蛋白豚等。

2、糖类:蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖。

3、盐类:硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化纳、硫代硫酸钠、醋酸氨、氯化镀。

4、醇类:山梨醇、乙醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇。

5、酸类:柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二胺四乙酸。

6、碱类:氢氧化钠、碳酸氢钠。

7、聚合物:葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯毗咯烷酗（PVP)。

8、其他:维生索、硫腺。

需要冻干的产品，一般是预先配制成水的溶液或悬浊液，因此它的冰点与水就不相同了，水在0℃时结冰，而海水却要在低于0℃的温度才结冰，因为海水也是多种物质的水溶液。实验指出溶液的冰点将低于溶媒的冰点。
      另外，溶液的结冰过程与纯液体也不一样，纯液体如水在0℃时结冰，水的温度并不下降，直到全部水结冰之后温度才下降，这说明纯液体有一个固定的结冰点。而溶液却不一样，它不是在某一固定温度完全凝结成固体，而是在某一温度时，晶体开始析出，随着温度的下降，晶体的数量不断增加，直到Z后，溶液才全部凝结。这样，溶液并不是在某一固定温度时凝结。而是在某一温度范围内凝结，当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点。而溶液全部凝结的温度叫做溶液的凝固点。因为凝固点就是融化的开始点（既熔点），对于溶液来说也就是溶质和溶媒共同熔化的点。所以又叫做共熔点。可见溶液的冰点与共熔点是不相同的。共熔点才是溶液真正全部凝成固体的温度。
       显然共熔点的概念对于冷冻干燥是重要的，因为冻干产品可能有盐类、糖类、明胶、蛋白质、血球、组织、病毒、细菌等等的物质。因此它是一个复杂的液体，它的冻结过程肯定也是一个复杂的过程，与溶液相似，也有一个真正全部凝结成固体的温度。即共熔点。由于冷冻干燥是在真空状态下进行。只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成液体的浓缩使冻干产品的体积缩小；而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来，造成象液体沸腾的样子，使冻干产品鼓泡，甚至冒出瓶外。这是我们所不希望的。为此冻干产品在升华开始时必须要冷到共熔点以下的温度，使冻干产品真正全部冻结。
      在冻结过程中，从外表的观察来确定产品是否完全冻结成固体是不可能的；靠测量温度也无法确定产品内部的结构状态。而随着产品结构发生变化时电性能的变化是极为有用的，特别是在冻结是电阻率的测量能使我们知道冻结是在进行还是已经完成了，全部冻结后电阻率将非常大，因此溶液是离子导电。冻结是离子将固定不能运动，因此电阻率明显增大。而有少量液体存在时电阻率将显着下降。因此测量产品的电阻率将能确定产品的共熔点。
       正规的共熔点测量法是将一对白金电极浸入液体产品之中，并在产品中插一温度计，把它们冷却到-40℃以下的低温，然后将冻结产品慢慢升温。用惠斯顿电桥来测量其电阻，当发生电阻突然降低时，这时的温度即为产品的共熔点。电桥要用交流电供电，因为直流电会发生电解作用，整个过程由仪表记录。
      也可用简单的方法来测量，用二根适当粗细而又互相绝缘的铜丝插入盛放产品的容器中，作为电极。在铜电极附近插入一支温度计，插入深度与电极差不多，把它们一起放入冻干箱内的观察窗孔附近，并用适当方法把它们固定好，然后与其它产品一起预冻，这时我们用万用表不断地测量在降温过程中的电阻数值，根据电阻数值的变化来确定共熔点。
      把电极引线通过一个开关与万用表相连，可以不分正负极。如果冻干箱没有电线引出接头，则可以用二根细导线从箱门缝处引出，在电线附近涂些真空密封蜡，这样不致于影响真空度。
      待温度计降至0℃之后即开始测量并作记录。把万用表的转换开关放在测量电阻的Z（×1K或×10K）。由于万用表内使用的是直流电，为了防止电解作用，在每次测量完之后要把开关立即关掉，把每一次测量的温度和电阻数值一一记录下来。开始时电阻值很小，以后逐步。到某一温度时电阻突然增大，几乎是无穷大，这时的温度值便是共熔点数值。

      用这种方法测量的共熔点有一定的误差，因为铜电极处多少有些电解作用。万用表对于高阻值没有电桥灵敏；另外，冻结过程与熔化过程电阻的变化情况并不完全相同，但所测之值仍有实用参考价值。

（来源：四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司）

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司

共晶点测试仪使用说明书

冷冻干燥技术是将含水物料预先冻结后在真空状态下进行升华而获得干燥物料的方法，干燥后物料原有的化学、生物特性基本不变，易于长期保存，是一种优良的干燥方法，被广泛应用于食品、生物制品、医药、化工、材料制备等各个领域。而在冷冻干燥过程中，物料的共晶点和共熔点是冻干工艺中最为重要的2个参数。物料的共晶点是指物料中的水分全部冻结时的温度。物料的共熔点是指完全冻结的物料，当温度升至某一值时，物料内部的冰晶开始熔化时的温度。由于冷冻干燥是在真空状态下进行，只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成冻干产品鼓泡，因此冻干产品升华时物料预冻温度要低于物料共晶点5～10℃，保证物料完全冻结，同时在干燥时加热温度不能高于物料的共熔点，否则在物料内部将会产生气泡或充气膨胀，出现融化和干缩现象，影响冻干制品的质量。

本仪器适用于液态物料的共晶点和共熔点测试。

一、主要特点：

1. 智能化自动判断物料共晶点和共熔点。

2. 采用两行式液晶显示屏，直接显示物料的共晶点和共熔点。

3. 实时显示当前物料温度。

4. 性能稳定、可靠，操作简单。

二、使用条件

1. 正常工作条件：环境温度：5℃～30℃

相对湿度≤85%

电源电压：AC（220V±22）V  （50±1）Hz

工作环境应通风良好，没有导电尘埃、爆炸性、腐蚀性气体及强电磁场干扰。

2. 运输贮存条件：环境温度：≤30℃

相对湿度：≤85%

贮存环境应通风良好，无腐蚀性气体。

三、系统构成

共晶点测试仪的实物外观如图1所示，测量探头及其支座如图2所示。

图1 共晶点测试仪的实物图

图2 共晶点测试仪探头示意图

1. 电源插座及开关

为共晶点测试仪的电源线接口及开关，打到“开”位置，系统上电，即开始正常工作，随着物料的冷冻或升温测试仪自动测量判断共晶点或共融点；打到“关”位置，系统掉电，设备停止运行。

2. LCD显示屏

LCD显示屏实时显示物料的当前温度以及共晶点和共熔点。其显示的Tnow为温度探头测量得到的当前温度，第二行显示的为测量得到的共晶点和共熔点，其中Tj为共晶点，Tr为共熔点，单位均为℃。

3. 测量探头及支座

共晶点测试仪的温度探头采用加长的Pt1000温度探头，阻抗探头采用特殊定制的不锈钢探针。为了实现探头的固定以及确保其相对位置，探头支座采用聚四氟乙烯材料加工装配而成，探头测量高度可通过高度调节旋钮进行调节，以适应不同高度的西林瓶和物料液面。

4. 探头接口

用于测量探头与测试仪主体连接，开始测量前，请确保探头插头与测试仪主体可靠对接。

四、操作步骤

1. 将待测试的物料装入西林瓶中，调节支架高度，使共晶点测试仪的探头能浸入物料液面下，再锁紧调节螺钉。

2. 将测试仪探头、支架以及装有物料的西林瓶放入冻干机内，关闭冻干机门。

3. 将共晶点测试仪的电源插头连接上220V交流电源插座中。

4. 打开电源开关，共晶点测试仪即自动进入共晶点共熔点测定程序。此时开启冻干机进行相应冷冻与加热操作即可。

五、注意事项

1. 请按规程先放置好待测物料后再打开测试仪开关。

2. 本系统的实时温度显示在+100℃及以上只显示“+HH.H℃”，-100℃及以下显示-LL.L℃，在-100℃至+100℃之间显示实际温度。系统在未测得共晶点或共熔点时，共晶点和共熔点温度显示为Tj=*****Tr=*****。

3. 测试仪内部电源为AC220V电源，非专业人员不要打开测试仪外壳，以免发生电击危险。

4. 请妥善保管测量探头及支座，不要对探头进行弯折或拆卸，以免造成不必要的损坏。

六、可能出现的故障及排除方法

可能出现的故障见表1。

表1 可能出现的故障及排除方法

对本机可能出现的任何故障，我公司均提供技术咨询和服务，必要时派专业维修人员上门处置。

本机自用户购买之日起，保修期限为一年。在此期限内，正确操作使用过程中发生机器故障，由我公司无偿提供各种技术服务；超过此期限，我公司可提供免费技术咨询和有偿维修服务，费用由我公司售后服务部门与用户商定。

前言

冷冻干燥工艺三个步骤：

预冻

—次干燥

二次干燥

其中预冻阶段除了将液体冻结为固体，还有将溶质与溶液通过相变进行分离的作用，因此一个好的预冻工艺不仅决定了后续步骤中干燥的效率，也会影响产品的关键质量属性（如：产品的水分，复溶速率等）。而在预冻工艺的设计中，退火是优化冻干工艺非常重要的一个手段。

预冻过程介绍

在退火程序开始前，溶液已经经历了一次预冻过程被冻结成固体，此时固体的组成对研究退火工艺至关重要。可以通过二元相图进行简要的描述预冻过程。

阶段一：

(A→B→C→D)溶液从室温A开始降温，到达冰点B，由于无晶核存在，不发生结晶，从而形成过冷溶液，当到达C点时，形成晶核，发生结晶，整个溶液温度会回到冰点D点让水继续结晶。

阶段二：

(D→Te)随着水结晶增多，未冻结相溶质浓度增大，当到达共晶点Te时，理论上会形成共晶体，但是实际上会有部分溶液无法形成共晶（根据溶质性质，形成共晶的比例会不同)

阶段三：

(Te→E→Tg’）非晶态溶液继续降温形成过饱和溶液，最终在Tg’点完全固化，形成玻璃体，同时玻璃体中也会包含部分未来得及结晶的水分子即结合水。

阶段四:

(Tg’→F）进一步降温，这时结晶相和非晶相比例不会改变，此时形成了一个即有水的冰晶，共晶体，玻璃体的混合物。

以上的四个阶段都是理想的状况，而实际的预冻过程会更加复杂，预冻速率的加快会加重这种复杂程度，首先有部分水分子没有来得及按照理想状况形成晶格，而被包裹进非晶相溶液中；其次结晶快速生长会将非均相溶液分散隔绝开，不同区域内溶质浓度、性质区别也很大，如表面富集现象。

退火的原理

退火程序是将已冻结样品由温度F点升高到一定温度维持，再降低到F点冻结的过程。

从动力学角度来看，退火过程遵循吉布斯-居里-乌洛普的表面能理论：晶体的平衡形状应该是使晶体单位体积具有最小的总表面积自由能，简单来说就是表面积；体积比值趋向于最小化，即小的体积变成大体积，片状变成球状或圆柱状。

从热力学角度来看，退火过程中存在两个变化，非晶态物质在高于Tg’时粘度会随温度升高而降低，从而发生流动、聚合；晶态的物质，小的冰晶分子会向大的冰晶迁移。

四环冻干机

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度”的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。 

我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发 展中追求卓越。

预冻操作时冷冻干燥机操作流程中diyi步，也是至关重要的一步，那么如何进行预冻操作呢？

冷冻干燥机预冻操作

1.准备好需要冻干的物料，并将物料放入物料盘里；

2.将已装好物料的物料盘都放入冻干室的搁板层上，并将物料温度传感器装入物料里的合适位置并固定好，关上有机玻璃门。

3.打开电源总开关，操作触摸屏到“设备操作屏”，打开压缩机，系统将自动打开搁板制冷，搁板开始制冷，预冻开始；物料预冻过程有两种方式：

（1）搁板直接制冷预冻：搁板制冷打开时，搁板制冷并一直降到搁板所能达到的Z低温度；

（2）搁板控温预冻：搁板控温打开时，搁板按预先设定的控温程序升、降温，实现物料预冻过程的温度控制，例如控温程序设定如下表。

参考控温程序

      表1控温程序的第1段～第8段为物料预冻过程的搁板控温程序，第9段～第18段为物料升华过程的搁板控温程序。手动控制模式下的物料预冻过程，设定起始段号为1、结束段号为8，启动搁板控温后，搁板温度将从第1段开始按上表的控温程序逐段控温，直到第8段执行结束，预冻过程的搁板控温结束。自动控制模式下的物料预冻过程，设定起始段号为1、预冻结束段号为8，干燥结束段号为18，启动搁板控温后，搁板温度将从第1段开始按上表的控温程序逐段控温，直到第8段执行结束，预冻过程的搁板控温结束，系统自动转入干燥过程，开始预冷冷阱、开启真空泵等动作。

提示：手动控制模式下预冻物料时，结束段号的恒温时间Z好设长点，这样可以在结束段号尚未结束时启动真空泵，直接修改起始段号和结束段号让程序进入升华过程，防止启动真空泵前搁板控温自动结束，引起物料温度回升。自动控制模式预冻物料时，预冻时间要充足，确保系统自动进入干燥过程时，物料已经到达冷冻要求。

特别注意：

1. 如果要快速预冻物料，可先对搁板层进行预冷，当搁板温度下降到合适温度（如-50℃）后，再将预先准备好的物料放入冻干室。

2. 物料预冻过程，触摸屏Z好停留在“数据查看屏”，即可实时查看温度参数及设备的运转情况，也可避免对设备产生误操作。

3. 物料预冻期间，严禁操作压盖装置，防止中间介质循环管路损坏。

北京四环福瑞科仪技术发展有限公司是一家专业真空冷冻干燥机及解决方案提供商，为客户提供从实验室型、中试型冻干机设备以及完整的真空冷冻解决方案。

四环福瑞真空冷冻干燥机LGJ-30G产品特点

1. 符合生物制药标准的结构设计。冻干腔体内部圆角、表面粗糙度、搁板平整度、腔体内部材料均满足制药标准；

2. 控制系统稳定可靠。采用PLC可编程逻辑控制系统和7寸彩色触摸屏，系统运行更稳定可靠，人机交互友好，中英文语言转换；

3. 实时显示记录真空度、冷阱温度、物料温度、搁板温度并形成冻干曲线，每分钟存储一次数据，可连续记录物料和设备状况数据，支持数据离线浏览、分析、打印及存储，配置USB通讯接口和TCP接口；

4. 冻干过程可控制。冻干过程均由可编程程序自动控制，半自动或全自动控制可实时切换，实现冻干过程全程参数控制；

5. 冻干室与冷阱腔体分离设计，实现了药品级中试机标准的同时更大的提高了捕水效率和能力；

6. 采用中间介质循环技术。搁度控温，板层温度均一、可控性强，板层平整，冷热量传导良好；

7. 双机复叠制冷技术。采用原装进口全封闭式压缩机组和国际标准绿色环保冷煤，制冷迅速，冷阱温度低，捕水能力强；

8.具有压缩机二次启动廷时保护及压力过载保护系统；

9.干燥室采用耐高压、耐低温航空亚克力材质高透明门，可观察物料冻干变化全过程；

10.搁板硅油制冷及加热，具有温度、速率可调、可控，实现原位预冻及升华功能；

11. 配置负压掺气系统接口。内置0.2μm滤芯，减少样品二次污染，可回填氮气或惰性气体；

12.冷阱具备自动化霜功能；

13.可选配自动压盖系统；

14.可选配洁净室安装方式，并提供洁净室安装解决方案；

15.可选配真空度调节功能实现冻干工艺摸索；

16.可选配共晶点在线测试功能，更好的优化样品升华工艺；

17.可选配计算机的无线远程实时监控和图表记录；

四环福瑞真空冷冻干燥机LGJ-30G技术参数

1、达标冷阱温度（空载）：≤-80℃ (环境温度≤30℃)

2、极限冷阱温度（空载）：≤-83℃ (环境温度≤25℃)

3、达标真空度（空载）：≤10Pa

4、极限真空度：1 Pa

5、Z大捕水量：8Kg

6、物料托盘、冻干量：

3+1搁板，层间距90mm，冻干面积0.3㎡，φ16西林瓶1240个，φ22西林瓶650个

7、搁板尺寸（长×宽）：335mm×300mm

8、搁板控温范围：-50℃～+70℃（控温精度：±1℃）

9. 物料温度探头：每层搁板1支

10、主机外形尺寸（长×宽×高）：700mm×800mm×1550mm(不含压盖）

11、整机功率：3300W

12、适用电源：AC380V  50Hz

13、整机重量：295KG

14、适用环境：环境温度≤30℃  

15、主要配置：主机一台、合资真空泵一台.

（来源：四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司）

5.5.3 冻结角膜的干燥过程

角膜干燥前，先开启制冷机，分别对冻干室、捕集器制冷，当冻干室内温度降到-20℃以下，捕集器内的温度降到-35℃时，迅速地把经过梯度降温的角膜放到冻干室，立即启动真空泵。在干燥过程中根据需要，调节充气阀，向冻干室内充入氯气以调节冻干室内的压力，同时根据需要调节制冷阀保证角膜冻干过程中所需要的热量供给，在干燥初期，不需开启加热器，此阶段角膜干燥所需要的热量靠外部传入即可得到满足，当冻干室内温度达到0℃时，开启加热器供给热量，但保证冻干室的温度不超过9℃，冻干结束，关闭真空泵，对冻干角膜进行充氮包装。实验中发现，角膜在磨口玻璃瓶中的放置方式（图5-14）对冻干角膜质量有一定的影响，试验表明，角膜悬于磨口玻璃瓶中，内皮细胞层朝下为最佳放置方式。如图5-14(b)所示。

角膜冻干过程热量的供给很容易满足，整个冻干过程可以视为传质控制过程，传质速率由细胞膜固有通导能力决定。干燥过程中，应根据干燥的不同程度，来确定冻干室内压力的高低以及所持续的时间，保证水蒸气由细胞膜孔隙溢出，且细胞膜内外压差始终很小，以减小对细胞的伤害。

由于角膜细胞很脆弱，在冻干过程中极易受到干燥应力、机械应力的损伤，冻干过程中低压时间过长或细胞膜内外压差过大，都会大大降低冻干角膜的成活率。变幅值、变周期的循环压力法应用于角膜的冻干，有利于角膜活性的提高。其根本原因是在整个干燥过程中，角膜细胞内外压差小，对角膜的损伤小。这主要源于两方面原因：一是通过控制冻干室内真空度的高低，以及循环时间的长短，使细胞内的蒸汽及时扩散到冻干室中，避免了细胞内饱和蒸气压过高，膜内外压差过大，造成细胞的损伤。当细胞内蒸气压较高时，开启充气阀向冻干室内充入氮气，在细胞膜外施加一压力，虽然此时传入细胞内的热量增多，使细胞内的蒸气压进一步升高，但此蒸气压的升高较细胞膜外压力的升高小得多，结果是细胞膜内外的净压差减小。然后，渐渐关闭充气阀，使冻于室内的真空度逐渐升高，这样角膜细胞内的蒸汽较平缓的通过细胞膜扩散到冻干室，减小了压差对细胞膜的损伤。当冻干室内真空度升高到一定程度，再逐渐充入氨气，传人的热量增多，开始了下一个周期。二是强化传热并促进外部传质，缩短冻干时间，从而减少了角膜内皮细胞受干燥应力损伤程度，具体工艺是读干室内温度到-25℃，真空度为50Pa时，开始第-次循环，温度每升高5℃循环一次，循环5个周期，温度达到0℃时，循环停止。压力时间关系曲线见图5-15，角腹的冻干工艺曲线如图5-16所示。

图5-17、图5-18分别为按上述工艺冻干角膜透射电镜检测结果、扫描电镜检测结果。从图5-17、图5-18可以看出，冻干角膜的内皮细胞间连接紧密，细胞轮廓接近于六边形。

细胞膜完整，细胞核膜完整，内皮细胞层与后弹力层连接紧密。这是因为整个冻干过程中，根据干燥的不同程度，来确定高室压、低室压以及所持续的时间，保证了水蒸气由细胞膜的孔隙溢出，即传质速率由细胞膜的固有通导能力决定，保证了细胞内外压差始终很小，减小了对细胞的伤害。

5.4.2 动物角膜的冻干

理想的角膜保存方法要满足技术简单、最大限度地保持角膜组织的活性、保持生理状态下角膜厚度和结构、有利于手术操作等要求。现有的角膜保存技术中，除了最有代表性的4℃湿房短期保存法外，还有受者血清保存法、器官培养保存法、甘油冷冻保存法、深低温冷冻保存法和无水氯化钙干燥保存法，这些方法都没能满足上述理想保存方法的要求。角膜冷冻真空干燥的目的是保持其活性，便于较长时间的贮存，使需求者能及时得到活性角膜，以便再植。

 5.5.1 角膜的冻干工艺流程                  

冻干角膜保持活性的关键是冻干工艺，角膜的冻干工艺是一个复杂的过程，如图5-12所示。影响冻干效果的因素很多，如保护剂的配制、角膜的冷平衡、梯度降温、冻干室内压力变化、温度变化，冻干角膜复水等。东北大学的王德喜对角膜的冻干进行了系列研究。研究中使用的是中国医科大学临床医院动物室提供的大耳白家兔，体重为2～3kg。

 5.5.2 角膜冻结过程中的冷平衡            

角膜在梯度降温过程中，要经受-150℃以下的低温损伤，在干燥过程中，要经受干燥应力的损伤，在没有保护剂保护情况下，经历如此损伤，角膜细胞很难保持活性。合理的选择和配制保护剂对角膜的保存至关重要。实验研究表明角膜由蔗糖、二甲基亚砜(DMSO)、20%安普莱士（人血白蛋白）作为保护剂，冻干效果良好。

为了防止角膜在冻结过程中损伤，还要对角膜进行冷平衡处理。冷平衡保护剂的具体配比见表5-12。具体操作过程：将无菌的角膜片先放入1号液，移入4℃冰箱冷平衡10min，然后用无菌镊子夹住巩膜边，将其移人2号液平衡10min，依次在3号液、4号液中各平衡10min。冷平衡工艺如图5-13所示。在冷平衡过程中，保护剂中的DMSO通过角膜的细胞膜进入到细胞中，置换出其中部分水分，在达到动态平衡前，保护剂中DMSO浓度要高于细胞中DMSO浓度。角膜依次在不同浓度的保护剂中进行冷平衡，这样角膜中的水分就会不停地与保护剂中的DMSO进行置换，经过一段时间的传质，细胞中的水分将大量减少。由于细胞内水分溢出速度与DMSO的浓度有关，为防止细胞内水分溢出速度过快造成细胞的损伤，使角膜细胞有个适应过程，角膜冷平衡采取逐步递增DMSO浓度进行平衡。冷平衡处理后兔角膜内皮细胞经联合染色检测，结果与新鲜角膜无区别，说明冷平衡对角膜内皮细胞的活性无损伤，该冷平衡工艺可行。

待角膜在4号液平衡结束后，立即取出放入磨口玻璃瓶里，在降温仪中进行梯度降温。梯度降温目的是使细胞内的溶液冻结成玻璃态，以使角膜迅速越过对细胞冻伤最严重温度区（-30～-60℃）时，细胞不受伤害。采用两步法进行梯度降温，第一步角膜距液氮面9cm，停留l0min，使角膜内部温度稳定在-16～-20℃范围内，此阶段角膜的降温速率为2～2.4℃/min;第二步角膜距液氮面1.5cm，停留10min，使角膜内部温度稳定在-130～-150℃范围内，此阶段角膜的降温速率为11～14℃/min。慢速降温时，细胞外的水易冻结成冰，电解质浓度升高，细胞内的水渗出细胞外，使细胞暴露在高浓度的溶质中，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解，造成溶质损伤。快速降温时，细胞内的水来不及渗出便结成冰，细胞内外同时有冰晶形成，容易刺破细胞造成机械损伤。这样必须快速慢速相结合，方可达到目的。由于冷平衡时，二甲基亚砜已经将细胞内的水分多数置换出去，在缓慢降温时，细胞内的溶质易形成玻璃态，可以避免溶质损伤。故可以先慢速降温，然后快速降温。两步法降温中，第一步慢速冷冻，将角膜温度慢速降至-20℃，可以避免过快冷冻时角膜内冰晶形成所造成的损伤和过慢冷冻时细胞置于高浓度溶液下时间过长所造成的溶液损伤。第二步快速冷冻，角膜以很快的降温速率降至-130℃以下，细胞内未冻溶液实现了非晶态固化，使细胞少受或不受损伤。

5.4 骨骼和骨 髓干细胞的冻干

       骨病和创伤引起的骨缺损或功能障碍是危害人类健康的主要原因之一。骨组织工程的提出、建立和发展为从根本上解决骨缺损的修复、结构以及功能重建提供了新的途径，但目前的组织工程骨构建需要较长的时间且保存条件苛刻，不能达到“随取随用”的最终要求。1942年古巴医生Inclan提出骨库概念，1950年美国首先在马里兰州建立海军组织库。骨库的建立使临床异体骨移植成为可能。

      5.4.1 冻干骨的生物性能                    

      早期保存异体骨的方法主要是冷冻和冻干处理，而冻干骨更被看好，来源包括肋骨、髂骨、下颌骨。这一点在后来Malinin等的动物实验得到了证实。他们以9只狒狒为实验对象，将冷冻骨与冻干骨分别植于动物胫骨近端对称部位并做了组织学观察，结果发现冻干骨不仅可以诱导成骨，且成骨速度优于冷冻骨。Sewell等分别在猴子下颌骨下缘两侧造成17mm×5mm的缺损，结果一侧接受异体冻干骨移植的6只猴子其下颌骨块处均获得愈合。Pike和Boyne采用大段冻干骨和自体骨 髓复合进行了狗和猴子下颌骨重建，证明异体冻干骨易于被宿主接受，但是6例实验中有2例与口腔穿通将自体骨冻干后植入狗的节段性骨缺损获得了成功，结果经统计学分析显示自体骨冻干前后的孔隙率、植入骨与宿主骨的愈合时间、新骨骨痂形成量、成骨后的力学强度等均无显著差异。

       1990年后，大段同种冻干异体骨移植研究继续发展，国内外众多学者分别进行了冷冻骨移植的临床实践，但整体来说大段异体骨移植还面临动物实验过少、临床工作不系统的问题，目前自体骨移植在矫形外科依然占据绝对主导地位。同时，随着骨库的蓬勃发展，以Stevenson、Enneking等为代表的一批学者做了大量基础和临床研究，大段同种异体骨移植在骨科得到了广泛和成功的应用。1993年Ellis等采用冻干异体骨结合自体松质骨进行了10例下颌骨重建，随访3.5年8例获得成功，2人出现并发症经过手术处理恢复良好。

         通过对西南医院数百例冻干异体脱钙骨基质(FDBM)使用患者的随访观察，使用冷冻和冻干处理三个月以上的异体骨降低了原本的免疫活性，虽有抗原残留但可以忽略其不良作用。自1965年Urist率先研究同种异体冻干骨的成骨功能以来，冻干脱钙骨基质(FDBM)在临床应用逐渐广泛。FDBM有良好的孔隙率及孔隙间连通率，同时还保留了一定的骨诱导能力，其表面拥有矿物沉淀的位点，能与启动和控制矿化的非胶原基质蛋白结合，因此还能促进矿物质的沉淀，促进骨生成。FDBM是应用特殊工艺制备的生物骨替代材料，由于精细的骨小梁结构和内部孔隙被保存下来，同传统骨替代材料羟基磷灰石等相比具有较好的生物活性，近年被引入国内并很快应用于种植外科。Iwata等总结了FDBM的优点：保留部分骨诱导成分，能常温贮存而基本不变质，可快速降解并被宿主骨替代，能长距离发挥骨传导作用。

       我国解放军总医院口腔颌面外科许亦权等的研究表明，冷冻干燥骨具有骨抗原性更低、保存条件宽松的优点，是骨库另一常用异体骨保存方法。但有人提出冷冻干燥处理将异体骨中的水分在短时间内降低到6%以下，造成骨胶原纤维发生微小裂隙，因此可以导致力学性能降低，也有人认为使用之前充分水化可以改善这一缺点。目前冷冻干燥法较多用于处理松质骨块，四肢大段承重部位骨不进行冷冻干燥处理，关于皮质骨接受冷冻干燥处理后力学性能特点的报道较少。许亦权的研究中采用的冷冻干燥骨试件测试前经过了6h水化，结果发现：与新鲜组相比，冷冻干燥组在抗压缩测试中最大载荷、最大位移降低，刚度升高，但是配对检验均无显著性意义，方差分析最大位移显著降低；在抗弯曲测试中冷冻干燥组的最大载荷降低30%，刚度升高41%，统计学差异显著。这一结果与冷冻组表现出的特点相似，统计结果也显示冷冻干燥组与冷冻组相比最大载荷、最大位移和刚度均无显著性差异。这说明经过冷冻干燥处理的犬下颌骨硬而脆，抗弯曲能力下降比抗压缩能力下降明显。像冷冻组一样，经过水化的冷冻干燥犬下颌骨仍然可以保持良好的外形并能提供较好的支持能力。

        侯天勇进行了冻干组织工程骨(FTEB)与组织工程骨(TEB)活性比较研究。取志愿者捐献的骨 髓和骨组织分别培养(hBMSCs)和制备脱钙骨基质(DBM)，取第3代hBMSCs与DBM复合构建TEB，分别于体外孵育3d、5d、7d、9d、12d、15d经过低温干燥后得到冻干组织工程骨。将FTEB、TEB和DBM分别移植于30只6周龄BALB/C裸鼠皮下进行异位成骨实验。移植术后4周各种移植物未见明显钙化；术后8周、12周，TEB和FTEB移植裸鼠皮下可以实现较好的异位成骨。通过X线片评分、CT值比较移植物钙化程度，TEB和FTEB差异无统计学意义，而DBM未见明显钙化。HE染色显示TEB和FTEB出现钙化，DBM降解吸收。可见，FTEB与TEB具有相似的成骨活性。

5.3.2  大鼠皮肤吹干与冻干比较研究

10年后，西北大学的杨维也进行了大鼠皮肤的冷冻干燥实验。他首先重点研究了浓度、孵育时间、孵育温度对大鼠皮肤冻干保护剂海藻糖负载量的影响。实验结果表明，大鼠皮肤对海藻糖的载入量的优化条件为：海藻糖浓度800mmo1/L,孵育温度37℃，孵育时间为7h。之后，皮肤组织分别进行冻干和吹干。

(1)冻干  皮肤组织在37℃加载海藻糖，4℃加载DMSO，将负载了海藻糖和DMS0的皮肤块放入冻存管内，冻存管放入程序冻存盒，置于-80℃冰箱冷冻。12h后将冷冻的皮肤组织连同冻存管转入预冷的冻干机，去掉冻存管盖子。冷冻干燥机运行状态参数为：冷阱中温度-45℃，冷阱上方温度0℃左右，真空度10Pa,冻干时间设置30h。先将皮肤样品置于冷阱中冻干24h，然后在冷阱上方冻干6h。先在冷阱中冻干是为了防止皮肤组织中固态的水分回融再结晶对组织产生冰晶损伤，组织中大部分游离水升华后转冷阱上方冻干，此时温度稍高可以进一步除去组织内部水分。

(2)吹干  皮肤组织在37℃、800mmol/L海藻糖培养液中孵育7h加载海藻糖，负载了海藻糖的皮肤用滤纸拭去表面残留液体，表皮朝下平展于玻璃培养皿中，培养皿敞口置于生物安全柜（打开送风开关）吹干。大鼠皮肤的吹干时间设置为20～30h可以将皮肤中水分去除较彻底，玻璃化状态良好。

经检测得知，刚冻干皮肤活性比刚吹干皮肤活性高1/3，保存时间延长到28d，冻干组皮肤活性与刚吹干组相当。冻干过程中，皮肤组织内水分先在DMSO保护下逐渐冻结，放入冻干机后固态水升华，由于海藻糖取代水分子的作用，干燥过程组织形态结构和活性不会发生变化，但在吹干过程中皮肤组织内水分由液态直接蒸发，原来包绕在细胞外的水膜以及和蛋白质等生物大分子结合的水分子可能还未完全被海藻糖取代就已蒸发。上述原因可能导致未保存的冻干皮肤活性高于吹干皮肤。干燥保存的皮肤活性开始降低速率较快，降到一定程度后降低速率减慢，所以保存一周后冻干组和吹干组皮肤活性没有统计学差异。

干燥保存的皮肤置于饱和湿度的恒温培养箱37℃预水化15min后，皮肤依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培养液室温下孵育15min，用不含海藻糖的无血清DMEM培养液漂洗3次以上，清除皮肤组织中残留的DMSO和海藻糖，最后转入无海藻糖的DMEM培养液中孵育2h，进行形态观察。如图5-10所示。

冻干皮肤玻璃化状态良好，呈半透明状。复水后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽。冻干皮肤角质层局部受损，而组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织没有差异。将冻干后复水的皮肤移植回自体大鼠，可存活13d。

自体移植后冻干组皮肤存活时间较吹干组长，可能是由于吹干过程对皮肤组织产生的损伤较大。冻干组皮肤在6d皮下出现血红色区域可能是自体动物在移植皮下发生血管化，但后来有两处变成暗红色，而其他区域血红色减弱消失可能是血管化失败，而吹干组未出现血红色，可能根本就没有发生血管化。

通过HE染色和透射电镜对比分析新鲜皮肤和干燥皮肤组织结构和细胞结构。HE染色结果显示干燥保存过程没有明显改变皮肤组织结构，也未影响皮肤组织的结构完整性。透射电镜结果说明干燥皮肤具有与新鲜皮肤无差别的细胞结构和胞外胶原结构，同时可观察到干燥皮肤细胞中结构正常的线粒体和平滑的核膜等细胞器。结构学观察结果证明干燥保存未对皮肤组织结构和细胞结构产生明显影响。

通过荧光标记和MTT活性分析研究干燥过程对皮肤活性影响。荧光标记结果表明，除毛囊处明显受损外冻干皮肤组织大部分区域在水化后能恢复活性。MTT活性分析结果显示冻干和吹干皮肤仍能分别保持58%和48%的活性。

5.3皮肤的冻干   

冻干皮肤在医学上的临床应用研究始于20世纪50年代。动物皮肤的冻干目的是用于对药物经皮肤渗透性的研究。由于透皮吸收给药新型的问世，药物经皮渗透性的研究正成为开发这类新型筛选药物的重要手段，由于大量长时间动物皮的需求，实际应用时常将待用皮放在冰箱里，可保存1周左右。时间再长，不但影响药理实验的稳定性，而且皮肤将变质。为增长皮肤保存期，可将动物皮肤冻干保存；人类皮肤冻干的目的是用于再植，为烧伤或外伤皮肤的病人植皮。

5.3.1 大鼠皮肤冻干工艺及药物渗透性实验

东北大学的郑文利博士早在20世纪末就进行了大鼠皮肤冻干的实验研究。取活大鼠脱颈处死后，立即用电动去毛刀去其腹部鼠毛，剥离皮肤，除去皮下脂肪层、血管及残留物，用蒸馏水冲洗干净，制成不同尺寸的皮片，再用生理盐水冲洗数次备用。将制备好的大鼠皮放在速率降温仪中，以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三种不同速率降温至-30℃。将三种不同降温速率预冻的大鼠皮，分别放入小型冻干机中抽真空，30min后压力稳定在120Pa,不主动加热，连续干燥34h后关机，充氮气后取出，用无菌塑料袋封装后，放在干燥器内保存。

将以不同预冻速率冻干的大鼠皮肤，经10%福尔固定，石蜡包埋制片，进行病理切片，切片厚度4～5μm,HE染色，再显微镜观察。新鲜大鼠皮组织切片如图5-8所示，以5℃/min速率预冻并冻干大鼠皮组织切片如图5-9所示。从图中可以看出冻干皮组织与新鲜皮组织相本相同，未见细胞破裂、上皮脱离、组织褶皱、细胞变性和细胞间隙增宽等异常，说明冻干皮组织结构未发生变化。其他速率预冻并冻干后的结果基本一致。

冻干大鼠皮角质细胞间隙脂流动性的电子自旋共振(ESR)测定：选  用5-噁唑氮氧自由基硬质酸(5-DSA)作为自旋转标记物，将新鲜的和  三种不同预冻速率的冻干大鼠皮角质层样品泡在浓度为1×10-4mol/L  的5-DSA缓冲液(pH=7.4)中12h，保温20℃，然后取出淋洗干净，37℃烘箱干燥1h，分别放进电子自旋共振波谱仪样品管内，再置于腔中。ESR测定条件：扫描宽度200G，接收增益3.2×104，时间常数20.48ms，微波功率5.02mW，扫描时间83.888s，调制频率  25.000kHz，调制幅度0.947G。经ESR波谱分析得知，三种不同冻  结速率预冻的冻干大鼠皮与新鲜大鼠皮各系数相比无显著差异，说明  冻干大鼠皮肤未引起表皮细胞间脂质结构的变化，大鼠表皮角质细胞  间脂质排列的有序性没有改变，流动性没有增加。

实验采用尼莫地平为模型药物（一种脑血管扩张药），选用预冻速  率为l5℃/min的冻干大鼠皮和新鲜大鼠皮做药物渗透性实验，考察其  组织结构有无变化。实验采用装置为V-lia-chien水平扩散池。它是由  两个等容积的玻璃半池组成，半池内径为l.35cm，有效扩散面积为  1.43cm2，容积为10mL。半池上方开口为取样口，池底有凹陷平  台，起到固定搅拌的作用。实验时将皮肤固定在扩散池的两个半池之  间，角质层面向供体池。水化1h后，供体池加入10mL尼莫地平的  30%丙二醇水过饱和溶液，接受池中加入10mL的30%丙二醇水，置  于32℃温水浴中，磁力搅拌，定时取样并更换全部接收介质。样品经  徽孔滤膜(0.45nm)过滤，续滤液，样品进人高效液相测定。尼莫地平  外含量测定采用高效液相色谱法紫外检测。色谱条件：色谱柱  Spherisorb46mm×25cm，检测波长237nm，流动相是甲醇/水  (64/36)，流速为1.1mL/min，进样量10μL。实验结果如表5-11所  示。

表5-11正常皮肤和冻干皮肤对尼莫地平渗透量比较

表5-11中的数据表明，在渗透9、10h、12h时，冻干皮肤与正常皮肤对药物尼莫地的渗透量无显若性差异。可见，冻干的大鼠皮肤能够满足药理的实验要求，可用做透皮制的实验研究，可以长期贮存备用。

5.2.6 猪丹毒疫苗冻干 

猪丹毒疫苗主要用于生猪生产中防疫。早在20世纪50年代，就有兽医药企业对猪丹毒疫苗的冻干进行了生产试验，给出了冻干工艺。之后又不断对猪丹毒疫苗的冻干工艺进行改进。南京兽医生物药品厂在70年代给出的冻干工艺为：-35℃开始升华，1.5h升至35℃保持14.5h，20mL瓶装7.5mL，干后菌存活率高达89.8%。制品共融点在-12℃左右，升华干燥7h后结束，疫苗温度约-12℃。苗内大部分水分在-10℃以下排除。14h后苗温和箱温接近一致，冻干曲线如图5-5所示。升华干燥期间，苗温与箱温有很大温差（约55℃），是制品在低温升华过程中排除大量的汽化热所致。解析干燥期间，供热主要用于排除菌苗中所含的少量水分，这一阶段供应相当多的热量，仅能排除有限的水分，是因为细胞内水分比细胞间的水分较难排除。研究表明，供热速度和温度的适应比装量多少、升华时间的长短具有更重要的意义。

5.2.7 猫泛白细胞减少症疫苗和“犬四联”弱毒疫苗冻干 

猫泛白细胞减少症是猫细小病毒引起的猫的一种急性、致死性传染病，乳发病猫死亡率最高，目前尚无治疗药物，需靠疫苗预防。李六金等研究了冻干猫泛白细胞减少症弱毒疫苗的冻干工艺。将疫苗按表5-9配方配制，经100℃恒温处理10min, 冷却到4～8℃，分装1mL/瓶，然后进行冻干。冻干工艺如图5-6所示。

通过上述工艺制备的猫泛白细胞减少症弱毒疫苗产品，为乳白色海绵状疏松团块，易于脱壁，残余含水量为3.0%～3.2%。加稀释液后迅速溶解，溶解后呈淡粉红色液体。经检测对比，冻干前后配苗毒液效价大致相同。肌肉注射给小白鼠和幼猫进行安全检验，结果被试动物全部键活。

冻干技术也可以用作混合疫苗的制备。李六金等还研究了“犬四联”弱毒疫苗的冻干。犬四联疫苗的配制按表5-10配方完成。

毒液配制好后，与稳定剂按1：1比例混合并分装成2mL/瓶。分装后的疫苗在LGJ型医用冷冻干燥机中冻干。

产品进箱后让冻干箱降温慢冻。预冻的最低温度-40℃，到达预定的-40℃后再保持1.5h。预冻结束减压，并在30min左右使真空度达到l0Pa，直至冻干结束为止。当真空度达到10Pa之后开始加热。总的冻干时间为20h。冻干曲线见图5-7。

冻干后的犬四联疫苗产品呈微黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离。加稀释液后迅速溶解成粉红色澄清液体。经检测，冻干后疫苗效价滴度比冻干前降低约0.5～1.0个滴度，属于正常范围。

5.2.8  甲型肝炎减毒活疫苗冻干 

液体剂型的甲型肝炎减毒活疫苗在市场上已经应用多年，并取得了较好的免疫保护效果，但疫苗需低温冻结保存，冷链运输。冻干的甲肝减毒疫苗，可方便于储运和使用。李光谱等研究了甲型肝炎减毒活疫苗的冻干。甲型肝炎病毒L-A-1株第23代，在人胚肺二倍体细胞ZBS株上大量培养后，分别制成纯化苗（经冻融、高速离心、PEG6000浓缩、氯仿抽提、Sephacryl S-400柱色谱等提纯，PBS缓冲液稀释，加适宜保护剂制成冻干疫苗)和未纯化苗（经冻融、超声、过滤等，加适宜保护剂制成冻干疫苗）。疫苗在ALPHA1-6冻干机中冻干。-50℃预冻，-50～30℃抽真空干燥6h，-30～-20℃抽真空干燥9h，-20～-5℃抽真空干燥5h，-5～28℃抽真空干燥10h。

甲型肝炎病毒属小RNA病毒，无脂蛋白包膜，一般不耐受冷冻干燥，解决无脂蛋白病毒冷冻干燥的问题需加入冻干保护剂。从实验结果看出，不同保护剂配方对冻干甲型肝炎减毒活疫苗冻干前后的病毒滴度影响较大，以山梨醇、蔗糖、脂肪酸盐(3%山梨醇、2%蔗糖、1%脂肪酸盐)配方为主的保护剂，保护效果好，冻干前后疫苗病毒滴度下降均在1.0以内，放置37℃ 1周下降0.5以内，符合规程要求。

未纯化疫苗中可能含有各种破坏性的酶（蛋白酶、脂肪酶等），冻干后37℃放置1周可能有一部分酶被激活，对病毒外壳结构和核酸RNA有破坏作用，纯化后无酶的影响，热稳定性较好。

5.2.3 冰核菌种冻干 

20世纪90年代初，朱红等发表了冰核菌种冻干的研究。冰核细菌大量附生于植物表面，并在-2～-5℃以下具有很强的冰核作用，在人工降雨降雪、人工制冰和生物免疫学检测方法中有很高的应用价值。朱红等人对冰核菌种的5种保存方法进行了比较研究。其中IHM4菌株的实验结果列于表5-6。

表5-6数据表明，对于IHM4冰核菌种，考虑存活力和冰核活力两个因素，冷冻干燥保存与灭菌水保存效果相当。但冻干后更方便储运，而灭菌水保存更为经济。该项研究没有给出具体的冻干工艺参数。

5.2.4 鼠疫菌种冻干 

为长期有效保存鼠疫菌种，使其不失原有的生物学特性，郑星铭等早在1997年就进行了鼠疫菌种的冻干研究，给出冻干工艺。活化的菌种接种于溶血赫氏琼脂斜面，28℃培养40h。将培养后的菌种研磨分散于1.5mL灭菌脱脂牛乳中，再分装在10支安甑中，每支约0.2mL、3~4mm高。为确保鼠疫菌种不被抽出，防止污染环境，每支安瓿的管口用灭菌脱脂棉松塞。将安瓿竖立在专用铝盒内，送入已经降温至-30℃的冻干箱内预冻。预冻1h后，继续降温2h后达-55℃。开启真空泵，升华干燥。干燥后加热升温至30℃，维持4～6h。工艺曲线见图5-4。菌种冻干后，放入带有吸湿剂的干燥罐内，抽真空后封口保存。郑星铭的研究报告中强调，冻结温度要低于牛乳的共晶点（-16℃）5～10℃，保证冻实。降温速率为10～15℃/h。第一干燥阶段除去90%以上的水分。第二干燥阶段除去结合水，温度相对要高，但不可高于30℃，以免影响制品的稳定性和活性。

5.2.5  麻疹减毒疫苗冻干 

麻疹病毒在液态下不稳定。多年的研究表明，麻疹病毒加入保护剂冻干后，稳定性明显改善。徐斌等通过正交实验研究了麻疹减毒活疫苗的冻干工艺。首先用电阻法测定麻疹减毒活疫苗的共晶点温度为-26℃。设计的正交实验因素水平见表5-7。

注：升华干燥E2过程，制品的温度始终控制在31℃以下。

实验研究中每次分装1800支、0.6mL/支麻疹减毒活疫苗进行冻干实验，然后对冻干制品进行水分、滴度、热稳定性检测，并计算干损率。实验研究的结果表明，优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺参数列于表5-8。以优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺冻干的制品成型良好，干损率平均为1.36%，稳定性好，残余水分在1.62%～1.67%之间。优化的麻疹减毒活疫苗冻干工艺适合麻疹疫苗大规模生产。

5.2.2 乳酸菌菌种冻干

能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌，共有200多种。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。乳酸菌种在酸奶生产中是非常关键的物质，可以利用乳酸菌提高酿造和发酵食品的风味。乳酸菌冻干是将菌种速冻，然后在真空条件下升华，可以保持菌种的稳定结构和营养。冻干后，菌种酶化作用减弱，生物活性不变，常温下可贮存3～5年。加水后极易复原，复水率达90%以上。冷冻真空干燥乳酸菌发酵剂，具有活力强、用量少、污染低、品种多、方便储运等特点，已在欧美等发达国家得到广泛应用。

影响乳酸菌冻干效果的因素包括菌株、细胞大小形状、初始细胞浓度、降温速率、pH值、保护剂、预冻温度、干燥条件、复水条件等，其中冻干保护剂系统的影响较突出。研究表明，乳酸菌冻干前加入适当的保护剂，可影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率和保藏期间的细胞稳定性。乳酸菌冻干保护剂的保护效果与其化学结构有着密切的关系，其特征是具备三个以上的氢键，而且具有以适当方式存在的游离基团。

5.2.2.1预冻方式对乳酸菌菌种冻干的影响

朱东升研究了预冻方式对冻干乳酸菌菌种活菌数的影响。实验中分别研究了嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌采用慢冻和液氮快冻后，冻干菌种活菌数与预冻方式的关系。具体实验方案为：将菌悬液盛入冷冻平皿中，将其先置4℃冰箱平衡30min后，移入-30℃冰箱60min,然后置-80℃冰箱60min,进行普通预冻，再在冷冻真空千燥机上冷冻千燥12h,密封保存于4℃冰箱中。其余菌悬液先置于冰箱保存30min后，用5mL、1mL、200uL、100uL枪头滴定于盛有液氮的冷冻平皿中10min,再在冷冻真空干燥机上冷冻干燥12h,密封保存于4℃冰箱中。实验设计冷冻真空干燥条件为：冻干室温度为-60～70℃，

压力为6mPa。

研究结果表明，三种菌种用液氮快冻都比普通慢冻存活率高，如图5-3所示。分析原因为，液氮预冻的速度比普通预冻的速度快很多，这样可以使细胞内部的水渗出到细胞外面，而水在细胞内部凝结正是细胞死亡的致命原因。此外，同样是用液  氯快冻，菌种液滴大小不同，其活菌数也不同，液滴小者活菌数高。当一定体积的菌液，由不同大小的液滴进行滴定，随总表面积增大，其存活率也增大。因为单位体积的菌液，其总表面积增大以后，水分的渗出速度也加快，所以存活率可以提高。

5.2.2.2冷冻干燥保护剂对乳杆菌冻干的影响

刘丹等研究了瑞士乳杆菌的冻干。将经过脱脂乳活化、培养基扩培并离心收集的瑞士乳杆菌菌泥与配制好的保护剂按1：1的比例混合，确定冻干前的活菌数后，注入冻干管中。冻干管在-75℃预冻2h,然后在60～120Pa下冷冻干燥32h，干燥后取出在4℃下保藏。用无菌生理盐水使冻干菌复水，确定冻干后活菌数，计算活菌率。实验研究中分别使用了单一保护剂和复合保护剂，实验结果列于表5-4和表5-5。

表5-4的数据表明，与对照组相比，加入保护剂后乳酸菌的存活率均有不同程度的提高，可见所选保护剂对乳酸菌都有一定的保护作用。其中以海藻糖的效果最为显著。与其他糖类相比，海藻糖的玻璃化相变温度高，更容易以玻璃态存在，对生物材料的稳定有很重要的意义。另外，生物体中的大分子均处于一层水膜包围保护中，这层水膜是维持其结构和功能必不可少的物质。干燥时水膜被除去，可导致这些大分子物质发生不可逆转的变化。若有海藻糖做保护剂，海藻糖可在生物分子的失水部位与这些分子形成氢键，使其在缺水条件下仍能保持其原有结构，保持活性。表5-5中的数据表明，与单一保护剂相比，使用复合保护剂冻干乳酸菌存活率更高。实验数据还表明，保护剂中海藻糖的在10.4%左右时效果更好，海藻糖浓度过高可能会抑制菌的生长。经过优化，最  佳的复合保护剂配比为10.4%海藻糖、11.2%脱脂乳和4%谷氨酸钠。

5.1  概述    

真空冷冻干燥制品在升华干燥过程中，其物理结构不变，化学结构变化也很小，制品仍然保持原有的固体结构和形态，在升华干操过程中，固体冰晶升华成水蒸气后在制品中留下孔隙，形成特有的海绵状多孔性结构，具有理想的速溶性和近乎完全的复水性，冷冻真空干燥过程在极低的温度和高真空的条件下进行的干燥加工，生物材料的热变性小，可以最大限度地保证材料的生物活性。制品在升华过程中温度保持在较低温度状态下（一般低于-25℃)，因而对于那些不耐热者，诸如酶、抗生素、激素、核酸、血液和免疫制品等热敏性生物制品和生物组织的干燥尤为适宜。干燥的结果能排出97%～99%以上的水分，有利于生物物质的长期保存。物质干燥过程是在真空条件下进行的，故不易氧化。实践证明，由于部分生物制品有特殊的化学、物理、生物不稳定性，冻干技术用于对它们的加工非常适合。

生物制品（如疫苗、菌种、病毒等）和生物组织（人体、动物体的器官等）的冻干与其他物品冻干工艺不同之处在于，它们在冻干过程中除了要达到一般物品冻干的指标要求外，在冻干过程中还要求不染菌、不变性，保留其生命力，保持生命活性，所以它们是所有冻干物品中工艺要求最为严格的。

疫苗、菌种、病毒等生物制品冻干后一般要制成注射剂，因此，总是先配成液态制剂，经冻干后封存，使用时加水还原成液态，供注射用。冻干生物制品注射剂是直接注射到人、畜血液循环系统中的。药剂若有污染，轻者造成感染，重者危及生命。因此，生产的各个环节都要特别注意消毒灭菌，保证产品的“无菌”要求。因此要对包括从盛装容器（安瓿、瓶塞等)到分装机、冻干箱、操作环境等所有可能与制品接触者进行灭菌消毒。

对生物组织的低温冷冻，可能引起细胞损伤，造成细胞损害的主要因素是冷冻引起的细胞内脱水，其次是机械性挤压作用。显微镜下观察红细胞在盐水和水溶液内冷冻时，可见到透明的网状冰结晶内有暗红色的红细胞聚积物。冰结晶开始呈网状，然后形成管状，最后形成一大片冰结晶。这样，细胞就可能被冰结晶挤压而受损伤。将细胞组织在冷冻过程中所受损害减低到最低限度，使细胞处于“生机暂停状态”主要的方法是应用冷冻保护剂、控制冷却速度和复温速度，以提高细胞在低温保存后的活力。

除人血浆等少数含干物质多的原料可以直接冻干外，大多数生物制品在冻干时都需要添加某种物质，制成混合液后才能进行冻干。这种物质在干燥后起支撑作用，在冻干过程中起保护作用，因此称为保护剂。有时也称填充剂、赋形剂、缓冲剂等。

冷冻保护剂能防止冰结晶对细胞的损害，可能是冷冻保护剂使最低共熔点降低，从而减轻或避免冷却或复温过程中冰结晶对细胞的损伤。冷冻保护剂依据其能否通过细胞膜而分为穿透性保护剂与非穿透性保护剂。穿透性保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)的作用是：①使细胞外液溶质浓度降低，冷却时细胞摄取溶质量减少，为DMSO所取代：②DMSO进入细胞内，改变细胞内的过冷状态，使细胞内蒸发压接近细胞外，从而减轻细胞内脱水和细胞皱缩的速度与程度；③减少进入细胞内的阳离子量；④由于DMSO容易进出细胞，在复温时很少发生渗透性细胞肿胀。此外，业已证实DMSO是经皮肤断面穿透至皮肤内部，尤以在4℃下5～15min穿透量最多。非穿透性保护剂，如羟乙基淀粉由于不能穿透细胞膜，仅使细胞外环境保持过冷状态，在特定温度下减低细胞外溶质浓度，延缓细胞破裂；或者在冷却前使细胞内脱水，减轻细胞内结晶。冻干人用生物制品活菌菌苗、冻干活毒以及冻干其他生物制品通常所用的保护剂依次见表5-1～表5-3。

《关于开展第三次全国土壤普查的通知》

时隔40年，第三次土壤普查启动。国务院日前印发《关于开展第三次全国土壤普查的通知》，决定自2022年起至2025年用4年时间，遵循全面性、科学性、专业性原则，全面查明查清我国土壤类型及分布规律、土壤资源现状及变化趋势，真实准确掌握土壤质量、性状和利用状况等基础数据。 

普查对象为全国耕地、园地、林地、草地等农用地和部分未利用地的土壤。其中，林地、草地重点调查与食物生产相关的土地，未利用地重点调查与可开垦耕地资源相关的土地，如盐碱地等。

普查内容主要包括四个方面：立地条件普查，包括地形地貌、水文地质等；性状普查，包括有机质、酸碱度、养分情况以及颜色、质地等物理、化学性状；类型普查，包括不同成土母质、不同气候条件、不同地形地貌、不同利用状况下土壤类型的核实与补充完善等；利用状况普查，包括灌排设施情况、植物生长情况、种植制度等基础信息，以及肥料、农药、农膜等投入品使用情况。

冷冻干燥技术在土壤冻干中的应用

真空环境下，水分子直接由固态变成气态，对待测样品的化学性质、物理性质及生物活性无影响，有效避免汞等挥发性物质损失。

经冷冻干燥处理后，土壤样品含水率低，一般可低于5%，极限可达到0.01%，有利于后续处理和分析。

对于土壤类冻干后，土壤样品呈现酥脆多孔的特性，便于使用专用研磨仪进行研磨。

冷冻干燥可无人值守，连续运转，干燥效率高，效率可达自然风干燥、晾干及烘干效率的几倍。

上样量大，一台专业型设备一天可制备上百个土壤样本，一台设备即可满足样本前处理的需要。

冷冻干燥法采用冻干瓶的方式可避免不同批次及同批次的交叉污染。

方便快捷，对于半挥发性有机物检测，专用的土壤冻干瓶即可用于采样，也可用于冻干，还可以用来封存样本。

四环土壤冻干机的特点

控制软件系统为安卓系统，冻干过程均有可编程程序自动控制，可实时切换为人工操作，实现冻干过程全程参数控制，在运行过程中系统自动监控检测并记录储存相关数据，可储存多个固定或自定义程序，储存程序≥ 100，每个程序步骤≥ 36，实现三级管理，可通过标配远程系统进行监控和检测维护，支持大数据和智慧实验室建设，审计追踪；

连续记录实时数据，绘制冻干曲线，每分钟存储一次数据（数据存储记录间隔时间可调），具备 USB 数据存储串口；

控制系统人机界面设备符合 NEMA（国际电气制造业协会）防护规定和欧洲 CE 电气认证标准；

系统配有各种传感器，实时记录显示真空度、冷阱温度、物料温度、搁板温度，运行错误报警，可在运行过程中温度和压力出现异常时即时信息报警并主动保护运行，灯光报警（选配）；

冻干腔体内部圆角、表面粗糙度、搁板平整度、腔体内部材料均符合或高于国家相关标准；

物料原位冻干，冷阱腔体、物料盘架为卫生级不锈钢材料，冷阱内无盘管，搁板可以拆卸，光洁耐腐蚀且易清洁，根据物料容器高度需求通过调整搁板层数自由调整搁板间距，冻干使用面积任意组配（最大有效冻干面积 0.83m2 ）；

物料搁板具有程序梯度电加热功能，特殊航空加热膜，运用 PLD控制，内置过热保护，安全可靠；（LGJ-35C/50C/80C 除外）

冷阱外置提高设备的捕水能力，减少冻干过程中冷阱温度对物料的干扰，保证物料冻干质量一致性，提高冻干效率，降低能源损耗；

采用进口压缩机单机混合制冷技术，国际标准绿色环保冷媒，制冷迅速，冷阱温度低，捕水能力强；具有自动化霜功能；

选配 UPS 不间断电源；

自动复压掺气系统：减少样品二次污染，可定量（选配）回填氮气或惰性气体；

提供洁净室安装解决方案；

真空度全程自动控制，可选配真空度调节功能；

选配共晶点共熔点测试功能，更好的优化样品升华工艺；

选配上位机控制。

达标冷阱温度： ≤ -70℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

极限冷阱温度： ≤ -75℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

达标预冻室温度： ≤ -55℃ （空载，环境温度 ≤ 30℃）

极限预冻室温度： ≤ -61℃ （空载，环境温度 ≤ 25℃）

达标真空度： ≤ 5Pa（空载）

极限真空度： ≤ 1Pa（空载）

预冻室降温速率：20℃降至 -40℃≤ 60min（空载）

冷阱降温速率：20℃降至 -40℃≤ 20min（空载）

真空抽气速率：标准大气压降至 5Pa ≤ 15min（空载）

搁板控温范围：-40℃～ +70℃ （LGJ-35C/50C/80C 除外）

电源要求：AC380V 50Hz 三相五线制 或 AC220V 50Hz 

总功率：4000W

适用环境：≤ 30℃

关于四环冻干

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度”的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。 我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发 展中追求卓越。 

个性服务：

专业沟通，科学分析，根据用户需求和物料 特性提供精准设备方案。

创新设计：

需求牵引，高端配置，结构紧凑，操作维护简单。

高效处理：

数字全程控制，实现系统优化，物料冻干高效。

技术保障：

快捷高品质的全寿命质量周期服务，保障产 品稳定可靠安全运行。

需要冻干的产品，一般是预先配制成水的溶液或悬浊液，因此它的冰点与水就不相同了，水在0℃时结冰，而海水却要在低于0℃的温度才能结冰，因为海水也是多种物质的水溶液。实验指出，溶液的冰点将低于溶媒的冰点。

另外，溶液的结冰过程与纯液体也不一样，纯液体如水在0℃时结冰，水的温度并不下降，直到全部水结冰之后温度才下降，这说明纯液体有一个固定的结冰点。而溶液却不一样，它不是在某一固定温度完全凝结成固体，而是在某一温度时，晶体开始析出，随着温度的下降，晶体的数量不断增加，直到最后，溶液才全部凝结。这样，溶液并不是在某一固定温度时凝结。而是在某一温度范围内凝结。当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点。而溶液全部凝结的温度叫做溶液的凝固点。凝固点就是融化的开始点（即熔点），对于溶液来说也就是溶质和溶媒共同熔化的点。所以又叫做共熔点或共晶点。可见溶液的冰点与共熔点是不相同的。共熔点才是溶液真正全部凝成固体的温度。

显然共熔点的概念对于冷冻干燥是重要的。因为冻干产品可能有盐类、糖类、明胶、蛋白质、血球、组织、病毒、细菌等等的物质。因此它是一个复杂的液体，它的冻结过程肯定也是一个复杂的过程，与溶液相似，也有一个真正全部凝结成固体的温度，即共熔点。由于冷冻干燥是在真空状态下进行的。只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华干燥，否则有部分液体存在时，在真空下不仅会迅速蒸发，造成液体的浓缩使冻干产品的体积缩小；而且溶解在水中的气体在真空下会迅速冒出来，造成象液体沸腾的样子，使冻干产品鼓泡、甚至冒出瓶外。这是我们所不希望的。为此冻干产品在升华开始时必须要制冷到共熔点以下的温度，使冻干产品真正全部冻结。

在冻结过程中，从外表的观察来确定产品是否完全冻结成固体是不可能的；靠测量温度也无法确定产品内部的结构状态。而随着产品结构发生变化时电性能的变化是极为有用的，特别是在冻结时电阻率的测量能使我们知道冻结是在进行还是已经完成了，全部冻结后电阻率将非常大，因此溶液是离子导电。冻结时离子将固定不能运动，因此电阻率明显增大。而有少量液体存在时电阻率将显著下降。因此测量产品的电阻率将能确定产品的共熔点。

正规的共熔点测量法是将一对白金电极浸入液体产品之中，并在产品中插一支温度计，把它们冷却到-40℃以下的低温，然后将冻结产品慢慢升温。用惠斯顿电桥来测量其电阻，当发生电阻突然降低时，这时的温度即为产品的共熔点。电桥要用交流电供电，因为直流电会发生电解作用，整个过程由仪表记录。

也可用简单的方法来测量，用二根适当粗细而又互相绝缘的铜丝插入盛放产品的容器中，作为电极。在铜电极附近插入一支温度计，插入深度与电极差不多，把它们一起放入冻干箱内的观察窗孔附近，并用适当方法把它们固定好，然后与其他产品一起预冻，这时我们用万用表不断地测量在降温过程中的电阻数值，根据电阻数值的变化来确定共熔点。

四环福瑞科仪科技发展（北京）有限公司法人由原北京四环科学仪器厂有 限公司技术研发和管理负责人担任，是为客户提供专业真空冷冻干燥设备及解 决方案的服务供应商。我们秉承“以客户为中心，追求最高的客户满意度”的 服务理念，个性服务、创新设计、高效处理、可靠保障，可根据用户需求提供 和设计单个或多个符合 GMP 相关标准的冻干设备配套系统，如负压和无菌隔 离器、自动进出料及外置 CIP 等系统。 我们以共赢发展为本，技术服务为根，在臻于完善中与众不同，在持续发 展中追求卓越。

授权生产企业：四环科仪科技发展河北有限责任公司

全国服务热线 :400-008-2009

心脏瓣膜的冻干

ALAIN C进行了心脏瓣膜的冻干研究。ALAIN提出瓣膜冻干应具备三项功能：第一，应该能够提供多孔结构，以便当使用瓣膜将其悬在介质中复水时，能允许纤维原细胞迅速进入瓣膜内部；第二，杀死异源细胞；第三，保持胶原质结构以保证瓣膜的机械强度。ALAIN的实验研究中用的是猪的瓣膜，来自屠宰场。猪的平均年龄和重量分别是18周和80kg。心脏瓣膜是在猪死后2h以内从心脏上切下来的，瓣膜片在磷酸盐缓冲液里洗涤三次。叶片在4℃下存储超过24h。实验中总共用到了76个叶片。

心脏瓣膜玻璃化温度的测定：

将质量为20～30mg的一块瓣膜叶片密封在铝制器皿中，使用装配有液氮低温附件的Perkin-Elmer DSC2仪器测量。以1.25K/min的速度冷却到173K，在以40K/min的加热速度过程中，记录温度，得到温度-热流图如图5-22所示。由图中数据得出，玻璃化转变温度Tg为-83℃。

冻干工艺对冻干心脏瓣膜形状的影响：

心脏瓣膜的冻干实验是在一种实验型快速冻干仪器中进行的，其结构如图5-23所示。 

将冷阱浸在硅树脂油的冷浴中冷却到-70℃，用旋片泵维持真空度，用麦氏计来测量真空度，可以达到0.005mmHg。

三个瓣膜叶片用一种单纤维尼龙丝系在一小块PVC塑料网上，装在一个Falcon塑料管中。大多数实验中，Falcon塑料管浸在液氨或控制了温度的硅树脂油中，瓣膜叶片在冷空气环境下冷冻。冷却Falcon塑料管的冷浴的温度为-15℃、-40℃、-80℃或者-196℃。然后，将Falcon塑料管从低温液体中取出，快速地放入冻干机的冻干箱里；少数实验中瓣膜叶片被直接浸入-60℃或者-80℃的酒精浴冷冻。样品的冻结速率数据列于表5-13中。在叶片角落里粘有一个与图表记录器相连接0.12mm的铜镍合金，用于测量温度。冻干室初始温度为室温22℃，然后通过浸在-20℃或-30℃的恒温浴里控制温度。之后，自然升温，此为非控制冻干。

真空干燥连续进行3h，这时叶片温度稳定在室温(22℃)。通过SEM对这些叶片的部分进行检查显示出预期的多孔结构，如图5-24所示。孔是由冷冻中形成和干燥中驱除的冰晶体产生的。而且有一个规律，冷却速度越低孔越大[对比图5-24(a)和(b)]，但不连续，每个样品也不一样[如图5-24(b)的例子]。叶片的厚度与冷却速度有直接联系。因为大多数孔的尺寸显得比预期的要小得多，可以尝试着在干燥前对叶片熔化和再冷冻，这样可以提高冰孔的尺寸。其他更多的叶片以6℃/min的速度冷却，在温度为37℃的水浴里熔化，然后以相同的速度再冷冻，三个以上再以72℃/min的速度冷却，但是它们产生了与仅仅经过一次冷冻的叶片相似的SEM外形。

另一个问题就是稠密层的出现，许多样品表面很显然没有孔[见图5-24(b)]；SEM图片显示叶片表面是压实的，内部孔和外部很少连通[见图5-24（c）]；在叶片物质内部同样出现了紧凑层[见图5-24(d)]。这些现象显示了在干燥过程中发生了广泛的坍塌，可能是在干燥过程中温升较快造成的。在处理结束，叶片的含水量很少，很可能是发生了熔化和蒸发，而不是升华。因此后面进行了严格的控制冷冻干燥实验。

在控制冷冻干燥过程中，选择了两种冷冻方法：将Falcon试管放在-40℃的冷浴里(平均冷却速度为6.7℃/min)，或者是放在196℃的液氮里（平均冷却速度为51℃/min)。将干燥烧瓶放在设定温度的冷浴里6h，它的温度就被控制在-20℃或-30℃；6h后关掉冷藏室，让浴温自动上升。测量的温升速度是0.06～0.08℃/min，从-20℃达到0℃需要5h，从-30℃到达0℃需要6.3h。总的真空干燥时间需要16h，最终温度为5～11℃。每个实验方案冻干了三个叶片，然后经过SEM检验。从8个瓣膜里得到的24个叶片都经过相同的处理，在干燥处理过程中或结束后和再水化后测量水的含量。结果显示在-30℃时的干燥速度是很慢的，20℃时尽管在那个阶段的最后将干燥时间从6h延长到12h可以保证水的含量很低，但是它对最后剩余水气没有影响。更多的研究是在为-20℃或-30℃温度下干燥6h的初始干燥后，再以0.06℃/min的加热速度进行第二次干燥，整个过程需要16h。

SEM照片（见图5-25）显示，-20℃干燥的叶片有更好的外观，多孔基体更统一，没有坍塌的区域和厚的、稠密的边界层。孔的尺度比非控制冷冻干燥的叶片看上去大很多[比较图5-24(a)和图5-24(b)与图5-25(a)和图5-25(b)]。冻结速率为7℃/min的叶片孔显得比50℃/min的叶片的孔稍大而且更均匀。-30℃干燥的叶片表面外壳更厚一些，显示了在第二个干燥阶段中已经发生了坍塌。这是由于在最初的温度为-30℃干燥6h后，有更高的水含量。所以，起初干燥的温度是-20℃。但是，在两种情况下，表面都缺乏明显的与内部多孔基体相连通的孔。

为了确定从SEM检查得到的压痕数量，测量了冻干叶片的厚度和孔的尺寸。图5-26显示了对两种冷却速度的数据比较，一种是非控制快速干燥，另一种是-20℃的控制干燥。不考虑干燥方法的影响，快速冷冻后叶片变得更厚了；同样，不考虑冷却速度的影响，控制干燥的叶片也更厚了。假如避免了崩塌，对于两种冷却速度，沿着垂线方向从内流到外流表面的冰孔数量相似。对分别经过1℃/min、5℃/min、25℃/min冷却速度的冷冻，然后进行初始干燥温度为-20℃的冷冻干燥的叶片，通过SEM测量了其孔的截面积的分布。在两个垂直方向上进行了表面观察，第一个是半径方向，即从容器表面指向容器中心；第二个指定的切线方向与第一个方向成90°，即它与容器表面的切线平

行。结果如图5-27所示。可以看出冷却速度(1℃/min)低，冻干样品冰孔尺度分布广，而且在断面的两个方向上没有显著的差别；冷却速度快则冻干样品冰孔尺度分布窄，而且切线方向上比半径方向上孔径更大，也就是说，冰晶体形成于切线方向。经测量，在两种冷却速度下，大多数冰孔半径方向上面积为100～350μm2，但是冷却速度为5℃/min的比25℃/min孔径稍长，样本的横断面积分别为400μm2和200μm2。冻干工艺为：以5℃/min的冷却速度，然后在-20℃真空干燥6h，接着在缓慢的加热过程中进行二次干燥，得到的冻干多孔叶片残余水分为8%～9%，内部孔的测量尺寸为100～350μm2。这对横断面积为150-200μm2的纤维原细胞提供了足够的通道。因此，在后来的所有研究中都采用了上述叶片冻干工艺。

SEM未能回答的问题：“内部冰孔与孔之间是互相连通，还是它们是独立封闭的？”为了回答这个问题，干燥前对叶片涂上荧光素，然后再用甲基安息香酸盐进行清洗后对它进行显微镜共焦扫描(CSM)，结果显示它的结构与开放的塑料泡沫相似。不过，SEM和CSM都暗示内部的多孔结构很少与表面联通。图5-28(a)和(b)显示了SEM的外观，流入表面上的凹陷很小(10~20μm),显得与内部的多孔结构不连通。CSM同样揭示了表面的口袋状结构，尽管横向连通的可能性不能被完全排除，但是它们似乎是封闭。

然而，当叶片被放置在玻璃皿上，大部分流人表面朝上，用1根8×20号手术针就可以创造出三角形的穿孔，直径尺寸为75~100μm[见图5-28(c)和(d)]，穿透了流出表面，孔径小于10μm。

ALAN的这项研究主要针对的是他提出的冻干瓣膜应具备的第一项功能：提供多孔结构，以便当使用瓣膜将其悬在介质中复水时，能允许纤维原细胞迅速进入瓣膜内部。