共聚焦显微镜原理

　　共聚焦显微镜也叫激光扫描共聚焦显微镜，普遍用于荧光成像和细胞分析，它成像清晰、放大倍数大、分辨率高，是生物医学领域中强有力的研究工具。

　　共聚焦显微镜是由显微镜光学系统、激光光源、扫描器及检测及处理系统4部分组成，采用相干性较好的激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对图象进行处理的一套观察、分析和输出系统。

　　如下图所示，激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，经过分光镜反射至物镜，聚焦在在标本上并进行扫描。样品受到激发后，发出的荧光回到分光镜聚集到探测针孔，Z后经过光电倍增管转化为电信号传输到计算机上显示为清晰的焦平面图像。激发光通过光栅针孔聚焦在样品上，荧光通过物镜聚焦在针孔上，此过程中形成两次聚焦，故被称为共聚焦显微镜。

　　普通生物样品切片结构复杂并且有一定厚度，利用普通荧光显微镜进行观察时，样品发射的荧光相互叠加，图像分辨率大大降低。

　　共聚焦显微镜的共聚焦成像能有效yi制焦平面外的杂散光和非测量光进入探测器，实现单一焦层面成像，使分辨率大为提高。载物台沿横向均匀移动时，可形成清晰的单层图像，沿纵向移动，可实现样品不同深度的逐层扫描，经过三维重建得到样品的三维立体结构，即所谓的“光学CT”。使用荧光探针对样品进行标记后再运用共聚焦显微镜观测，不仅可观察固定的各种细胞和组织结构，还可对活细胞的形态、结构、离子等进行定性定量定时观察及测定。

　　1665年，diyi台光学显微镜的问世，为人类打开了微观世界的大门，成为研究生物器官、组织和细胞的重要工具，极大地推动了生命科学相关领域的发展。随着现代科学技术的飞速发展，以及yi疗、生命科学、材料科学以及相关工业领域等的广泛应用需求，人们对微观事物的认知要求已不仅局限于二维图像观测，同时需要对微小物体的三维结构进行了解和研究。普通显微镜原理为物面前后一定厚度

　　共聚焦显微镜可以进行细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并能提供定量荧光测定、定性图像分析等研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域有广泛应用。

　　传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。而共聚焦显微镜则在荧光显微镜成像基础上利用激光作为光源，采用共轭聚焦装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统。

　　共聚焦显微镜主要组成包括：显微镜、激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集，处理，转换，应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统。

　　1、激光器：随着激光技术的飞速发展，共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器、如：R-HeNe(633nm)、ArUV(351、364nm)、HeCd(442nm)、AR(458、477、488、514nm)、ArKr(488、568、647nm)、Kr(568nm)、G-HeNe(543nm)、Diode(405nm)等。

　　2、照明针孔：照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的。激光经照明针孔形成点光源，相干性好，频率、振动方向、相位高度一致。

　　3、光束分离器：从样晶上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器将激发和释放光束分开。

　　4、物镜：选大数值孔径平场复消色差物镜为好，有利于荧光的采集以获得更清晰的成像。

　　5、焦平面：激光点光源照射标本，在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。该光斑经过物镜、光束分离器等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测器针孔两处聚焦，共聚焦的含义由此而来。

　　6、探测器针孔：起到空间滤波器的作用。Zda限度地阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来

　　共聚焦显微镜与传统显微镜相比，具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点。随着软件开发和应用技术的完善，共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

　　共聚焦显微镜样品制备是检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记(单标、双标、三标)。

　　标本可以是固定的或活的组织，也可以是固定的或活的贴壁培养，细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上，悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。样品的Zda厚度约1~2mm，使用的盖玻片厚度应小于0.17mm，载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，而且表面光洁，厚度均匀，没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片，常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。

　　常规样品制备要求：

　　1、染料的选择

　　由于共聚焦显微镜是以单一波长的激光作为光源，因此在选择荧光染料时要根据共聚焦显微镜配备的激光器波长选择，如果在同一样品中有多种荧光染料标记，还要考虑它们的发射波长尽量不要重叠，避免串色问题。

　　2、样品承载物的选择

　　一般的共聚焦显微镜高倍物镜均为油镜，它的数值孔径较小，要求镜头与样品之间的工作距离不大于0.17mm，因此如果观察样品为贴壁细胞或组织切片，可以用普通的载玻片和盖玻片即可。如果是悬浮细胞或悬浮粒子，可以用共聚焦显微镜专用的培养皿承载样品进行观察。

　　3、封片剂的选择

　　如果样品只需要观测一次并且不是极易淬灭的荧光，可以选用一定浓度的甘油混合液封片即可。如果样品需要放置一段时间并多次拍摄，应选用抗荧光淬灭的封片剂，以减少荧光信号丢失。

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　　①根据荧光探针的激发波长和发射波长，选择合适的激光器、激光功率，分光镜滤片和发射滤片。

　　②确定扫描方式：点、线、面、三维扫描。

　　③确定扫描密度(分辨率):

　　共聚焦显微镜与普通显微镜相比，采用了能到达Zgao分辨率及重复性的无色差扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。

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　　1、扫描Z终图像清晰度不高

　　造成此类问题的原因主要有两个：

　　①物镜和ZOOM值选用不正确：

　　初学使用者大多喜欢选用共聚焦显微镜10x物镜后，再将ZOOM值调到所需要的Zda值。通过ZOOM值的增大确实可以将图像放大，有助于看清图像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于物镜的倍率。例如在10x物镜下，ZOOM值超过10就没有意义了，而且ZOOM值的增大属于电子放大，放大倍数越高，清晰度越差。所以在所观察的样本形态体积较小的情况下，多采用高倍物镜(例如63x水镜或油镜)，再适当调整ZOOM值，ZOOM值Z好不超过2。

　　②误将Z-Position旋转球的功能和共聚焦显微镜焦距微调旋转器的功能等同：

　　在准确调焦的基础上，通过Z-Position旋转球的左右调节，可以观察到目标样品图像由Z轴距离变化而引起的图像清晰度的改变，感觉上和通过调焦使图像变清晰一样。因此很多使用者在没有调焦准确的情况下，直接使用-Position旋转球来调整图像清晰度而导致成像模糊。

　　2、扫描背景强，图像质量差

　　解决这个问题的关键在于要根据样品的制备质量选取合适的针孔大小，调整激光管电压、光电倍增管功率、信噪比等参数到Z佳状态。这些参数或设置有非常密切的关系，选择时应该综合考虑。

　　还有一种明场出现环状波纹背景的情况是由于操作者在使用共聚焦显微镜观察荧光样品后，没有将荧光滤镜退出并切换到扫描状态所致。此时只需要转动调节轮至Scan即可。

　　3、串色

　　在使用多种荧光染料标记样品时或是样品本身有很强的自发荧光时，串色的现象就很容易发生。串色又分为两

　　共聚焦显微镜的应用广泛，实验数据可靠，分析处理软件功能丰富。在细胞及分子生物学、药物筛选、大脑和神经科学、免疫学、形态学、食品卫生、发酵、遗传学、药理学等领域具有不可替代的作用。

　　共聚焦显微镜的功能主要分图像处理功能和细胞生物学功能两个方面：

　　一、图层处理功能

　　1、组织光学切片：

　　共聚焦显微镜利用照明点与探测点共轭特性，可有效yi制同一焦点平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，从而获得普通光镜无法达到的分辨率。

　　共聚焦显微镜以一个微动步进马达控制载物台的升降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”，得到各个层面的信息。这种功能也被称为“细胞CT”或“显微CT”。

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　　2、三图像重建：

　　共聚焦显微镜通过薄层光学切片功能，可获得真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理及三维重建软件，沿X、Y和Z轴或其它任意角度来观察标本的外形及剖面，并得到三维的立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态观察，并揭示亚细胞结构的空间关系。

　　3、细胞物理会生物化学测定：

　　共聚焦显微镜可进行低光探测、活细胞定量分析和重复的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异结构的含量、组份及分布进行定性、定量、定时及定位测定;同时还可测定分子扩散、膜电位、氧化-还原状态和配体结合等生化反应变化程度。

　　4、荧光的定量、定位分析：

　　共聚焦显微镜可对单标记或双标记细胞及组织标本的共聚焦荧光进行定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化;同时还可自动将荧光图像与象差图像重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。

　　共聚焦显微镜还可测量标本

　　共聚焦显微镜是上世纪80年代发展起来的高科技产品。它通过在荧光显微镜上加装激光扫描及共轭装置，用紫外或可见光激发荧光探针，并利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构。共聚焦显微镜是细胞生物学、生物化学、药理学、生理学、遗传学、胚胎学、神经生物学、微生物学和寄生虫学等多学科强有力的研究工具。

　　1、尼康

　　尼康的共聚焦显微镜系统的激光共聚焦部份叫Clsi，光学部份用TE2000系列显微镜，由于其共聚焦显微镜进入ZG较迟，同前的市场占有率较低。特点是：采用32个光电倍增管的光谱检测器，可全部或部分同时工作;光栅效率增强技术，使接收信号强度提高;双积分器信号处理技术，信号采集时损失少。

　　2、奥林巴斯

　　奥林巴斯的共聚焦显微镜是FVl000系列。特点是：应用同步双扫系统-SIMScanner，当一束激光对样品进行刺激的同时，另一束激光同时采集到高分辨率的成像，实现光刺激和观察同步进行。应用GX离子沉积镀膜技术的滤光片，增加了系统的灵敏度，使共聚焦显微镜能够观察极弱的激光所激发出的荧光，从而把对活细胞的损伤减至Z小。

　　3、徕卡

　　徕卡共聚焦显微镜为TCS-SP5型。特点是：内置5组Leicadu家ZL可程序调控分光光谱检测系统，每一组的光谱范围广达400-850nm间(波长分辨率2nm)。因为，光通过滤镜的数目减少，其光学穿透有效率更高，影像更为鲜明，解析更高。棱镜分光的ZL设计保证了高信噪比的优势，光程Z短，中间滤片不再需要，光能透过率达88%，棱镜的光能损失只有3%，总光能损失只有10%。非常好的光传导性可以检测到更微弱的荧光，避免了其他公司为提高灵敏度而加大激光激发强度进而导致样本的荧光淬灭。

　　4、蔡司

　　蔡司在共聚焦显微镜方面有一系列的产品：

　　LSM 510 META DuoScan型是通用型共聚焦显微镜，其特点是：采用X和Y轴