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将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

技术原理

混合模板DNA和有荧光素的Taqman探针，遵守聚合酶链反应规律使高温变性，低温复性，适温延伸的热循环完成，切断和模板DNA互补配对的Taqman探针，荧光素在反应体系中游离。荧光在特定光激发下发出，被扩增的目的基因片段随着循环次数的增加呈指数级增长，Ct值根据实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度求取出来，同时对照多个已知模板浓度的标准品，就能够使待测标本目的基因的拷贝数得出。

荧光化学分方法

实时荧光定量常用的荧光化学分为有Tag Man探针法和SYBR Green I法两类。

1.TaqMan探针法

TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中，有荧光淬灭基团存在于3′ 端标记，有报告基团存在于探针的5′ 端标记，探针仅和模板特异结合，两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到，伴随反应的进展，Taq酶遇到探针，探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断，从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量，从而使荧光信号产生，所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。

2.SYBR Green I法

SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料，其发射波长Zda约为 520 nm，Zda吸收波长约为 497 nm，能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态，SYBR Green I发出的荧光较弱，然而其结合双链 DNA之后，就会使得荧光大大增强，

荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。这个方法的优点是其能够对所有dsDNA 序列的扩增进行监测，有着比较简单的检测方法和比较低廉的成本，但是也正是因为荧光染料能够结合所有的dsDNA 。那么非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合，使荧光信号产生，导致实验结果假阳性，所以探针法的特异性要比该方法的特异性要更高。由于和目标产物相比较，非特异性产物和引物二聚体的变性温度要更加的低，因此，能够在可以在熔解曲线反应过程中，信号可以通过软件分析仪器来收集从而鉴别。

与荧光定量pcr原理相关文文章：

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

定量方法

在实时荧光PCR中，模板的定量包括相对定量和定量2种方法。相对定量是指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。定量通常根据已知的标准曲线来使我们所感兴趣基因的拷贝数确定。

1.相对定量法

相对定量法又分为比较Ct值的相对定量法和比较标准曲线的相对定量法两种方法。

（1）比较Ct值的相对定量法

该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段，扩增反应既能够在两个反应管中也能够在一个反应管中进行，并且通过两者的ct值的差来测量。在采用此方法过程中，相对量的计算需要用到数学公式。靶基因和内源控制物的扩增效率大体上相同是该方法的前提。因此应用过程中效率的偏移会或多或少影响实际拷贝数的估计。所以，反应体系的优化的加强是目的基因和内参基因的扩增效率相等的保障。

（2）比较标准曲线的相对定量法

相对定量法指的是在一定样本中，靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法，在使用该方法过程中，参照物必须准备，因此定量标准曲线的绘制比较容易，只要确定了标准品稀释度就能够进行对比分析。

2.定量

定量是通过已知的标准曲线推算出未知样本的量的方法。该方法，需要对标准样品的浓度情况进行明确，再将标准样品稀释。分为几个不同梯度浓度然后进行反应测试。纵坐标为测得的Ct值，横坐标为标准品拷贝数的对数值，从而将标准曲线绘制出来，基于标准曲线，在对未知样品定量分析的过程中样起始拷贝数能够通过ct值被推算出来。

应用

食品安全

食源微生物、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌、食品过敏源等检测。

科学研究

医学、生物、农牧相关分子生物学的定量研究。

临床疾病诊断

肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断；各型肝炎、结核、性病、艾滋病、禽流感等传染病诊断和LX评价；地中海贫血、性别发育异常、智力低下综合症、血友病、胎儿畸形等优生优育检测。

动物疾病检测

禽流感、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、新城疫、口蹄疫、猪瘟、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。

应用行业

各级各类YL机构CDC、检验检疫局、兽医站、大学及研究所、食品企业及乳品厂等。

与荧光定量pcr检测方法相关文文章：
• 荧光定量PCR检测方法

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

两个概念

1.Ct值

t代表threshold，C代表Cycle，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，即为Ct值的含义。

2.荧光域值(threshold)的设定

荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号，3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍为荧光域值的缺省设置。

传统定量只能终点检测的不足之处，通过实时荧光定量PCR技术可以将其有效的解决，使得荧光信号的强度每一轮循环就能够检测一次并且在电脑上记录下来得以实现。在电脑软件之中，通过计算每个样品Ct值，按照标准曲线就能将定量结果得到。所以基于如下两点，实时荧光定量PCR可以不需要内标。

a.Ct值与起始模板的线性关系

因为Ct值与起始模板的对数存在线性关系，未知样品的定量测定能够根据标准曲线。所以实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

b.Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，真正的指数扩增期（对数期）刚刚进入，这个时间误差很小，还没有被放大，所以Ct值有极好的重现性，也就是时间相同不同管内扩增或者不同时间相同模板扩增，会得到相同的Ct值。

特点

1.重复性好

2.检测速度快

3.自动化程度高

4.特异性强

5.灵敏度高

与荧光定量pcr特点相关文文章：

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域。

在食品检测方面的应用

1.转基因

利用荧光定量PCR技术扩增放大转基因信号。

2.微生物

食品安全和人民群众的生活息息相关，在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中，食品会受到来自微生物的污染。食品中的致病菌可以通过荧光定量PCR技术来检测。

在环境监测方面的应用

河流中环境微生物随着季节变化的情况能够通过实时荧光定量PCR技术被检测出来，地表水和饮用水中致病菌也可以通过实时荧光定量PCR技术进行检测。

在分子生物学领域的研究应用

1.用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析

不同人群对疾病的易感性和对同一种药物ZL同一种疾病的效果也不形同，个体差异的遗传是基于遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP。SNP广泛地存在于人类基因组中，为Z常见的一种人类可遗传变异，对于遗传性疾病的研究具有重要的意义。

2.DNA甲基化检测

表观遗传学重要的标记信息为DNA甲基化，对于表观遗传学的时空特异性研究来说，由实时荧光定量PCR技术将基因组甲基化水平数据得到具有重要意义。

3.定量核酸浓度

核酸浓度测定的传统方法是使用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳，测定的结果不仅不够精确而且容易受到污染。上述的问题通过实时荧光定量PCR就能够解决，实时荧光定量PCR具有很高的准确性和灵敏度并且没有污染。该技术是定量分析某些传染性疾病和检测病原微生物和病毒的shou选。

4.研究基因表达

基因时间、空间表达水平差异的比较能够应用实时定量PCR技术。

在医学领域的研究应用

1.用于病原体检测

定量常规PCR做不到，在操作中容易受到污染从而使假阳性结果出现，然而该问题应用实时荧光定量PCR技术能够解决。提供疾病的诊断和ZL依据、抗结核药物ZL后病人痰样本病原体DNA含量的定量检测、丙肝病毒、宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒的检测均可以应用该项技术。该项技术还能够对量大肠杆菌样本一次性的检测，非常简单准确。

2.肿瘤基因检测

肿瘤具有非常复杂的发生机制，目前，尚不清楚它的发病机理。随着基因分子水平研究不断发展，目前被人们广泛接受的致癌性发生的根本原因是肿瘤基因发生突变等遗传学改变。在多种肿瘤早期和良性阶段就已经出现癌基因表达异常和突变。

与荧光定量pcr应用相关文文章：

将荧光基团加入到PCR反应体系中，通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现，再根据标准曲线定量分析未知模板的方法，即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中，实时检测全程PCR扩增过程，按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。

注意事项

1.操作规范

需要规范样品核酸提取和实时荧光扩增时的操作，避免样品交叉污染， 酶被降解，出现假阳性的情况。

（1）根据试验的分区严格操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，不能够逆向流动物品、样品和试剂。 

（2）在对多份样品进行操作的时候，制备反应混合液，首先混合好荧光PCR反应液、荧光探针和酶。之后在每个PCR管中进行分装，如此不仅会使操作次数减少，而且能够使污染避免，还能够使反应的精确度增加。

（3）在对样品和蛋白酶k添加的过程中，要对避免酶的降解和样品的交叉污染尤其留心。

（4）在操作的时候，需要将阴性及阳性对照设立，能够对荧光PCR反应的准确性和可信性进行验证。

（5）使用的离心管、枪头和PCR 管需要确保没有污染，或者将它们进行高压灭菌。

（6）在完成核酸的提取之后应当立刻进行仪器的扩增，不能够在室温环境下过长时间放置提取的核酸，空气中的酶能够轻易的将其降解，其可以在－70 ℃冰箱内长期保存，在 －20 ℃冰箱内短期保存。

（7）因为产物气溶胶或标本 DNA 会很容易对移液器造成污染，所以需要使用可高压处理的移液器。

2.温度设置

在对荧光 PCR 程序进行设置的时候，应当需对程序中的目标温度、恒温时间和循环次数等参数仔细的核对，PCR 检测结果会受到不正确的参数设置的影响。延伸过程中，需要对荧光信号的读取收集进行设置。如果不对收集荧光进行设置，那么试验数据将无法保存，检测结果将没有办法判定，从而导致试验失败。

3.仪器摆放

放置实时荧光定量 PCR 仪的台面应当平稳，离水池较远，少灰，干燥，不能有强光直射，室内应当没有腐蚀性气体合良好的通风。

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