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蛋白质印迹实验是学生物的同学们的必备技能，一般需要1~2天的时间，由于过程繁多，结果差异较大，因此也称为是相对定量。那么我们平时做WB的时候会遇到哪些问题呢？

Q1

我的检测结果为什么没有信号或者信号很弱？

可能的原因1：转移蛋白失败或者效率太低

解决方案

 1  印迹过程冷凝效果不好导致高温产生了气泡，或者胶/膜变行等情况从而影响了转印效率。

 2  优化丙烯酰胺浓度/转移时间/电流。

 3  重新检查印迹过程：使用染料对胶和膜染色来检测或使用预染的彩虹marker来帮助监控转印的过程。

可能的原因2：检测系统

解决方案

 1  推荐使用斑点印迹系统检测抗原与一抗结果，并筛选合适的浓度。对于一抗的优化，我们推荐起始浓度可以按照1:100、1:500、1:1000、1:5000稀释。

 2  低亲和力的一抗：使用无Tween的溶液。

 3  独立点膜，验证二抗与发光液预混后曝光，应可清晰看到膜上点，否则请检测二抗效价或发光液效果。

可能的原因3：样本上样量不够，信号过低

解决方案

 1  增加上样量或上样前浓缩样本。

 2  使用灵敏度更高的检测体系（ Amersham ECL prime货号 RPN2232/Amersham ECL Scelect 货号 RPN2235高灵敏度化学发光检测试剂）

 3  延长曝光时间（1~2小时）。

可能的原因4：蛋白与膜结合较弱

解决方案

 1  转膜缓冲液中的SDS可以提高难溶解蛋白的转印效率，但是也会降低蛋白和膜的结合效率，可以降低SDS含量或者不使用SDS。

 2  使用新换的膜以确定正确的水合作用。

Q2

为什么我的条带是空心的？

解决方案：

 1  由于蛋白浓度过高导致的底物消耗完毕，建议稀释样本浓度

Q3

背景太高？

可能的原因及解决方案：

 1  印迹膜选型不合适或有蛋白污染 ：提高封闭试剂浓度或延长封闭时间。换用更低背景的 Protran Premium(PTP) 印迹膜。

 2  洗涤不够 ：增加洗涤次数，延长洗涤时间。洗涤缓冲液中添加 0.1%(V/V) 的 Tween-20。( 可以在洗涤缓冲液中添加 0.5 M NaCl 或者 0.2% SDS 有利于降低背景 )。

 3  封闭不足 ：更换封闭试剂，并确保封闭试剂充分溶解。提高封闭试剂浓度和延长封闭时间。

 4  二抗浓度太高 ：优化抗体浓度

 5  封闭试剂与抗体交叉反应，需更换封闭试剂：比如检测磷酸蛋白，建议使用 BSA 代替牛奶作为封闭试剂， 因为牛奶中含有磷酸化的蛋白。

 6  一抗、二抗浓度太高 ：优化抗体浓度。

 7  上样量太大 ：降低上样量

Q4

分子量大的蛋白转印效率低

可能原因及解决方案：

 1  甲醇浓度太高：降低甲醇浓度至 10%（V/V）以下。

 2  蛋白结合时间不够：使用湿转代替半干转。延长转印时间。

 3  蛋白凝胶浓度太高：降低凝胶浓度，转印 buffer 中添加 0.1%SDS，促进蛋白溶解。（注意：SDS 可以促进蛋白的溶解，但是也会破坏蛋白与膜的结合）

Q5

分子量小的蛋白转印效率低

可能的原因及解决方案：

 1  小蛋白在膜上结合量少：使用蛋白结合能力更强的膜。增大 SDS-PAGE 凝胶浓度。

 2  使用小孔径印迹膜，如 0.1 μm 或 0.2 μm Protran 印迹膜。

 3  转印 buffer 中残留的 SDS 影响蛋白与膜的结合：转印 buffer 中不要有 SDS。转印前凝胶与转印 buffer 平衡至少 15min 以上。

 4  转印 buffer 中甲醇浓度太低：提高甲醇的浓度（15%-20%）

 5  蛋白结合时间不够：调低电压，延长转印时间。