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从细胞培养物等粗样品中亲和纯化mAb是治 疗性抗体工艺开发和生产过程中的标准程序。由于蛋白A选择性地与IgG抗体结合且具有高亲和力，因此蛋白A亲和纯化是一种广泛应用的纯化策略。磁珠凭借其易用性也成为一种常用的纯化介质。蛋白A偶联磁珠兼具蛋白A的高选择性以及从纯化样品中有效去除磁珠的优点。

下面小编向大家介绍，直接从细胞培养基中收获的治 疗性mAb进行纯化和酶解的全自动工作流程。该方法使⽤蛋白A磁珠进⾏纯化，然后进行酶解/还原的联合操作。利用 Andrew+移液机器人实现整个样品制备过程的自动化，得到可供 Waters BioAccord LC-MS系统分析的mAb亚基。

BioAccord LC-MS系统是一款飞行时间质谱仪，专为生物制药工艺和产品开发中的常规监测而设计，用于完整分子量、肽图、Peptide MAM多属性方法、游离N-糖、细胞培养基等的分析。

图1. 抗体纯化和酶解直至亚基LC-MS定量分析的完整工作流程（本次介绍Subunit analysis, 对于Glycan Profiling, Peptide Mapping的样品制备，Andrew+也有对应的自动化方案）。

优势

1、用于mAb纯化和酶解的全自动方案，8个样品并行处理需要2 h，48个样品大约需要3 h，但同样的制备过程手动执行至少要半天，约4 h。所以，自动执行mAb纯化和酶解可以比手动操作节省25% - 50%的时间。

2、基于浏览器的OneLab软件可在任何电脑/平板上运行，拖拽式操作，简单易上手，是真正能让分析人员学会用的自动化软件，无须编程背景。

3、该程序可用于制备低至0.5 μg的有限样品量和高达10 μg mAb的样品量，因此适合与微型生物反应器和更大规模的生物反应器装置配合使用。

在介绍该实验方案之前，让我们看一下蛋白A磁珠纯化和酶解会用到的3个高级装置。

实验方案

使用了未转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养基，培养了15天，进行了0.2 μm过滤，使用了Magne蛋白A磁珠。

表1. 用于mAb纯化和酶解的所有试剂和材料列表。

实验过程

图2. 使用蛋白A偶联磁珠进行抗体纯化的示意图。

本研究中，使用FabRICATOR (IdeS)蛋白酶在铰链下方的特定位点裂解抗体，然后通过DTT还原轻链与重链之间的⼆硫键，生成mAb亚基（大小为23 - 25 kDa）。亚基比完整的mAb更均⼀且质量数足够低，可以使用价格适中的MS仪器获得质量足够高的谱图，同时仍然提供相当短的分析时间和简化的数据解析。

图3. 使用Andrew+进行自动化抗体纯化和酶解，以及使用Waters BioAccord系统进行快速LC-MS分析的工作流程。

实验结果

纯化样品的LC-MS分析得到所有三个亚基的高质量谱图，可对不同修饰（如Fc糖基化）进行相对定量。未纯化的细胞培养物样品的直接LC-MS分析未得到适合分析的亚基。

利用手动方案（图4b）和Andrew+机器人方案（图4c）生成的蛋白A纯化和酶解的mAb的LC-MS结果相似，且所有平均亚基质量数与对照样品结果相当。

图4 . a-c. 进行纯化和酶解的mAb亚基的LC-MS分析结果；d. 未纯化酶解的mAb。

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