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背景介绍

单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用，单细胞测序已经让我们能以全新的方式理解细胞的生化过程。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况。近日，来自中国科学院深圳先进技术研究院研究员陈万泽以第 一作者身份在国际知名期刊Nature上发表长文，使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法Live-Seq，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。

1. Live-Seq测序技术简述

由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，陈老师的团队首先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能地接近Smart-Seq的测试条件，团队采用了首先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够第一时间与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。

图1. Live-Seq技术

a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指液体位置；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。

2. Live-Seq技术分析细胞系的细胞状态

为了证实Live-Seq的有效性，陈老师团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。

图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态

3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响

Live-Seq技术的优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察中，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。

图3. Live-Seq对细胞活力的影响

a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图； 

4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件

由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验中发现，Live-Seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达非常相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。

图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析

5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序

Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。

图5. Live-Seq对细胞的多次提取，连续测序的示意图和代表图像；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。

总结

Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。