仪器网（yiqi.com）欢迎您！

 前言

复 方多粘菌素B软膏为硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸利多卡因组成的复 方制剂，用于预防皮肤割伤、擦伤、烧烫伤、手术伤口等皮肤创面的细菌感染及暂时缓解疼痛等不适症状。硫酸多粘菌素B为多肽类抗生素，通过干扰细菌膜通透性与核糖体功能而导致细菌死亡，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、嗜血杆菌等有良好的抗 菌作用。硫酸新霉素为氨基糖苷类抗生素，可阻碍细菌核糖体30S亚基相联结的蛋白质合成，引起其遗传密码错读而导致细菌死亡，抗 菌谱较广。杆菌肽为多肽类抗生素，通过抑 制细菌细胞壁粘肽的合成而导致细菌死亡，主要对革兰氏阳性菌尤其对常见的金 黄色 葡萄球菌和各种链球菌抗 菌活性强，对革兰氏阴性球菌和某些放线菌、螺旋体、阿米巴原虫也有一定的抑 制作用。盐酸利多卡因为酰胺类局部麻醉药，其作用机制为阻止神经脉冲的发生、传导与传播。

多粘菌素B和杆菌肽作为多肽类抗生素，通常采用液相色谱紫外检测器法或微生物法测定。而硫酸新霉素的紫外吸收较弱，一般采用通用型检测器进行分析。盐酸利多卡因则采用另一种液相色谱紫外方法进行检测。因此对于该复 方制剂，可能需要2~3种液相色谱检测法来分析其主要成分，其质控流程较为繁琐和耗时。也有研究采用HPLC-ELSD法来分析上述4种主要物质，但该方法易受到复杂基质的影响，灵敏度和重复性往往不能满足检测需求。

本应用尝试采用HPLC-CAD法对这4种主要成分同时进行检测分析，考虑到这4种主要成分有的缺乏紫外生色团，有的紫外吸收波长较低，易受干扰。但这4种主要成分通常不挥发，电雾式检测器（CAD）非常适合作为主要的检测手段。与蒸发光散射检测器（ELSD）或示差折光检测器（RI）相比，CAD可兼容梯度洗脱，具有更高的灵敏度，可降低复杂基质的干扰。

多粘菌素B结构式：                                        硫酸新霉素结构式：

杆菌肽结构式：                               盐酸利多卡因结构式：

实验方法

2.1仪器

Thermo Fisher Vanquish Core高效液相色谱仪，泵：Quaternary Pump C，自动进样器：Split Sampler CT，柱温箱：Column Compartment C，CAD检测器：Vanquish CAD H。色谱软件：变色龙Chromeleon 7.3

2.2试剂

乙腈、甲酸、三氯 乙酸（色谱级，Fisher），去离子水（18.2 MΩ@25°C，Millipore纯水机）。

2.3仪器

硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸利多卡因

2.4样品

市售复 方多粘菌素B软膏

2.5色谱条件

色谱柱：Phenyl 4.6mm×250mm，5 µm
柱温：40°C
检测器参数：蒸发温度50℃，采集频率5Hz，Filter 3.6s，PFV 1.0
进样量：5µL
流动相A：40mM三氯 乙酸，B：甲醇， C：乙腈
梯度洗脱：参见表1
流速：1.0 mL/min

表1：梯度洗脱程序

3. 实验结果

3.1 专属性和线性范围

分别取硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸利多卡因适量，用水溶解并稀释得到一系列不同浓度的混标溶液，考察专属性和线性情况。各单标溶液及空白溶剂叠加色谱图如图1所示，结果表明该方法条件下各物质分离效果、峰形及峰响应均良好，空白溶液无干扰。

图1：4种单标及空白（黑色）叠加色谱图

混标溶液的典型色谱图如图2所示，取4~40ppm浓度范围的混标溶液分别进样，绘制标准曲线。

图2：混标溶液典型色谱图

图3：各物质的标准曲线

结果显示， 各物质在其浓度范围内线性良好，相关系数均≥ 0.997（见表2）。

表2：方法线性结果

3.2 灵敏度

将混标溶液不断稀释并进行检测，通过信噪比（S/N）值来考察CAD检测器对硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸利多卡因的灵敏度。如图4所示，当混标浓度为8ppm时，各物质的S/N接近定量限要求；当混标浓度为4ppm时，各物质的S/N接近检测限要求,结果表明HPLC-CAD方法灵敏度较高。

图4：各物质的检测限（LOQ）和定量限（LOD）

3.3 重复性

取浓度为20ppm的混标溶液连续进样6针后计算各物质峰面积的%RSD，来考察CAD检测器的重复性，结果见表3、图5。

表3：各物质重复性结果

图5：重复性结果色谱图

3.4 样品分析

取市售复 方多粘菌素B软膏样品适量，加水混匀，振荡30分钟后离心3分钟，取上清液过微孔滤膜后直接进样分析，实验结果表明样品中各物质峰形，灵敏度及分离度等均符合分析要求（图6）。

图6：市售样品色谱图

 结论

本应用建立一种HPLC-CAD法，可对复 方多粘菌素B软膏中的硫酸多粘菌素B、硫酸新霉素、杆菌肽和盐酸利多卡因这4种主要成分同时进行检测分析。该方法灵敏度较高，检测限可低至4µg/mL；重复性好，连续6针峰面积%RSD均＜2.5%；基质干扰小，市售产品中的各物质峰基本不受基质影响。本应用方法方便、快捷，可有效提高检测效率，缩短产品质控流程。