经验分享︱无需方法转换,常规HPLC色谱柱也能实现UHPLC分离性能
近年来,UHPLC系统在小分子分析中的应用已得到了研究人员的广泛认可。UHPLC系统是在常规HPLC系统上对死体积、进样性能和检测器采样率等方面进行了优化,能够承受超过1000 bar的操作压力。因此,对于在常规HPLC系统上开发的方法,使用UHPLC仪器和HPLC色谱柱更能够发挥优势。
如果在UHPLC系统上使用常规HPLC色谱柱,就不需要再去购买UHPLC色谱柱并开发新的方法,这样可以节省相当的成本和时间。
本应用展示了常规TSKgel HPLC色谱柱在UHPLC系统上出色的分离性能。
应用实例(一)
使用阳离子交换色谱柱TSKgel SP-STAT分别在HPLC系统(蓝色谱图) 和UHPLC系统 (红色谱图) 上,分析单克隆抗体IgG的情况。实验中采用了相同的色谱柱、样品以及分析方法,以验证色谱柱-系统的兼容性。
结果表明,SP-STAT色谱柱在UHPLC系统中的理论塔板数要高6%,明显优于在HPLC系统中的性能。
图1. SP-STAT色谱柱分析IgG的谱图
图2是使用SP-STAT色谱柱考察了在常规HPLC系统和UHPLC系统中,单克隆抗体异构体洗脱曲线被优化的程度。UHPLC色谱图的峰宽更窄。系统死体积减少导致峰洗脱早于HPLC系统。
图2. SP-STAT色谱柱分析mAb电荷异构体的洗脱曲线
应用实例(二)
图3是使用尺寸排阻色谱柱TSKgel G2000SWXL对标准蛋白混合物的分析情况。色谱柱在连接UHPLC系统时,对氨基苯甲酸 (PABA) 的理论塔板数超过了32000 (红色谱图),而连接HPLC系统时,相同组分的理论塔板数只有29000 (蓝色谱图)。
图3. 标准蛋白混合物的分离谱图
当然,评估色谱性能时,分离度也是非常重要的一个指标。分析结果显示,在分离γ-球蛋白和卵清蛋白时分离度为2.1,分离核糖核酸酶A和对氨基苯甲酸时分离度为10.2。而观察UHPLC的数据可以发现,对应峰的分离度分别提高到了2.2和10.9。
总结
以上两个分析实例均表明,当使用UHPLC系统时,可获得分离更好、分辨率更高的分析结果。UHPLC系统仅仅是优化后的HPLC系统,因此从HPLC到UHPLC的方法转移并不比从一台HPLC仪器向另一台HPLC仪器转移要复杂多少。
以上应用中的操作压力远未超出常规HPLC系统的极限。大多数生物大分子的分离分析所采用的压力大抵如此,但许多生物样品分子本身无法承受太高的压力。利用HPLC技术的ZX发展趋势,将使用HPLC色谱柱已建立的HPLC方法转移到UHPLC系统是一种经济、省时的策略。
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