蛋白样品制备流程----阿拉丁试剂

分类：商机 2023-06-02 10:05:40 1577阅读次数

一、蛋白提取

蛋白分析的第一步是蛋白提取，蛋白提取方法包括化学抽提法、物理抽提法和生物学抽提法。蛋白提取无论通过机械处理还是基于去垢剂的提取方法，都会不可避免地破坏细胞稳态，导致蛋白降解或不稳定。因此，提取过程中蛋白的完整性直接决定了下游蛋白样品分析所得数据的质量。

样品类型

关于内源性蛋白和表达系统蛋白的研究来源主要包括哺乳动物细胞，哺乳动物组织和原代细胞。当提取哺乳动物组织中的蛋白质时，需要一些温和的酶或机械破碎手段来帮助从较复杂组织基质中分离细胞。对于仅通过质膜将细胞内容物与环境隔离开的培养哺乳动物细胞和原代细胞来说，试剂中的去垢剂可打破蛋白-脂质膜双层结构，使总蛋白提取更为容易。通常所研究的或用于重组蛋白表达系统的其他生物体包括细菌、酵母和植物。这些细胞类型含有细胞壁，需要额外使用酶解或机械破碎的方法才能有效释放蛋白。然而，目前已开发出基于去垢剂的解决方案，可有效提取和溶解这些细胞中的蛋白，而无需机械外力破坏。该方法对于处理更多样品数量或使用自动提取和纯化方案来说尤其重要。

亚细胞分级分离

对于大多数研究来说，只需直接制备全细胞裂解物以获取可溶蛋白样品，用于下游直接检测或进一步纯化与分离。但是，如果在蛋白提取之前将细胞分为不同的区室或细胞器，可以显著提高特定蛋白的产量或富集率。机械裂解通常会破坏所有细胞区室，使分离特定细胞组分变得更加困难。但是，通过谨慎优化试剂，已开发出基于逐级差异去垢剂的方法来分离核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白组分。该方法可以将疏水性膜蛋白溶解，使其与亲水蛋白分离，并且可以分离完整细胞核、线粒体和其他细胞器，用于直接研究或分步提取蛋白。

二、蛋白质降解

细胞裂解时会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白水解活性不受调控，从而降低蛋白产量并影响蛋白功能。为了防止提取的蛋白降解并保持其活性，通常需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

蛋白酶抑制剂通过与蛋白酶活性位点结合而起作用。由于蛋白水解机制的差异，单一化合物无法有效抑制所有蛋白酶，因此，需要使用几种不同抑制剂的混合物来确保蛋白提取物在下游分析之前不被降解。典型的抑制剂混合物包括丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶等小分子抑制剂，以及氨基肽酶和金属蛋白酶。尽管有些抑制剂是不可逆的，但很多抑制剂是可逆的，它们需要长时间存在于粗制样品中，直到后续进行了纯化，免除了蛋白水解活性的风险为止。

同样，磷酸酶也各有不同，因此建议使用有效的磷酸酶混合物（含丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、酸性和碱性磷酸酶的抑制剂）来保持脆弱的磷酸化翻译后修饰。
通过使用正确的保存方法来防止靶蛋白降解：
快速操作并保持样品低温（可使用液氮冷冻样品）；
抑制或灭活内源性蛋白酶和磷酸酶；
添加保护或稳定化合物，例如还原剂和酶抑制剂；
通过沉淀稳定或灭活蛋白。

三、蛋白样品除杂

蛋白提取后，蛋白样品通常含有影响蛋白稳定性或与下游应用不兼容的杂质。透析、脱盐和浓缩是去除蛋白样品中常见小分子污染物（例如盐和去垢剂）的三种常用方法。根据下游应用要求，选择方法时的考虑因素可能包括样品起始量、蛋白功能和处理时间。透析、脱盐和浓缩的有多种规格和包装形式。

透析

透析是一种经典分离技术，它通过半透膜选择性扩散，去除蛋白溶液中的小分子和不需要的化合物。将样品和缓冲液置于膜的相对侧。大于膜孔的蛋白保留在膜的样品侧，较小的分子（污染物）通过膜自由扩散，直至达到平衡浓度。这种技术可以使样品中小分子污染物的浓度降低至可接受水平。

脱盐

常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相，使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。

浓缩

蛋白浓缩与透析法类似，其使用半透膜将蛋白与小分子量化合物分离。与透析法的被动扩散原理不同，浓缩是通过离心使溶液穿过膜而实现的。在离心过程中，缓冲液和小分子量溶质均被动穿过膜，并在另一侧收集（滤液）。大分子（蛋白）保留在膜的样品侧，其随着试剂被动穿过膜到达另一侧而浓缩为小体积液体（截留液）。

四、蛋白定量

紫外分光光度法

蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定结果，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：

1.当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。

2.若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。

荧光法蛋白定量

基于荧光进行蛋白定量是除比色法以外的另一选择。荧光检测法具有出色的灵敏度，所需蛋白样品量少，可节省更多样品用于其他实验。此外，读取时间并非关键因素，因此这种检测方法可轻松应用于自动化高通量分析。可使用荧光计或酶标仪检测荧光信号。

Bradford法

1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，是一种能够迅速并且准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度(最低检出量为1μg)。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子如K+，Na+，Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。

总氮量的测定——微量凯氏定氮法：当被测定的含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮与硫酸化合成硫酸铵。由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂(过氧化氢)也能加速反应。

消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸气蒸馏，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。

双缩脲法

具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。

Folin-酚试剂法

测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。

此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。

五、蛋白检测

根据实验需要，可以使用多种方法来检测和分析靶蛋白。以下是用于检测和分析复杂混合物（例如裂解物和血清）中蛋白质的常见技术，以及各种技术的特点和常见要求。

	ELISA	蛋白质免疫印迹	质谱分析
优势	可进行 96-孔或 384-孔板的高通量分析可定量靶蛋白	分子量测定和蛋白鉴定可以对靶蛋白进行分离和区分	在同一份样品中定性和定量多个靶标检测蛋白翻译后修饰或不同亚型
灵敏度	<5–10 pg/mL	从低飞克到高阿克	摩尔范围（1018）
裂解液兼容性	对于非活性检测 ELISA：基于离子型去垢剂的裂解液对于活性检测 ELISA：基于非离子型去垢剂的裂解液（例如 NP-40、Triton X-100）	对于 SDS-PAGE（变性）：RIPA 或含其他含离子型去垢剂的裂解液对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）：基于非离子型去垢剂的裂解液（例如 NP-40、Triton X-100）	质谱分析前必须去除样品中的去垢剂和高盐物质
常规所需蛋白量	0.1–1 µg/mL	1–50 µg	<1 µg
所需设备	酶标仪	X 光胶片或 CCD 成像系统	质谱仪

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