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KRAS（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）基因属于RAS基因家族，KARS基因编码的KRAS蛋白是一种小GTP酶（small GTPase），与GTP结合呈激活状态，与GDP结合呈关闭状态。KRAS突变是癌症患者中最常见的功能获得性突变之一，占RAS突变的85%。长期以来KRAS靶向治疗一直是癌症精 准治疗领域的关键目标。但由于KRAS蛋白结构上缺乏较深的疏水性口袋，且KRAS与GDP、GTP之间具有皮摩尔级别的结合亲和力，蛋白表面除了GTP结合位点外几乎找不到其他小分子化合物结合口袋，因此从被发现以来的几十年间，KRAS一直被认为是不可成药的靶点。

2021年5月29日，首 款KRAS靶向药物Sotorasib（AMG510）被FDA正式批准。该抑 制剂可以将KRAS G12C捕获在其非活性构象中并抑 制患者的肿瘤生长。然而，在癌症中发现的最普遍的非G12C KRAS突变体被认为缺乏GAP辅助的GTP水解，并且以非兴奋或组成活性状态存在。非活性状态选择性抑 制是否可用于治疗靶向非G12C KRAS突变体仍在研究中。

2023年5月31日，来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心 ( MSKCC ) 和勃林格殷格翰（BI）公司的研究团队在Nature发文 Pan-KRAS inhibitor disables oncogenic signalling and tumour growth，报道了一种非共价抑 制剂的发现和表征，该抑 制剂优先结合并且与KRAS的非活性状态具有高亲和力，同时不影响NRAS和HRAS，具有广泛的治疗意义。

为了开发不区分KRAS突变体的小分子泛KRAS抑 制剂，研究团队首先从G12C选择性抑 制剂BI-0474中移除共价弹头，并应用基于结构的设计优化以获得有效的非共价抑 制活性。共价弹头的移除大大降低了G12C抑 制的效力，但研究者意外发现，尽管效力较低，无弹头支架不加选择地抑 制了由KRAS突变体驱动的增殖。结合晶体结构分析，进一步优化生成BI-2865，它可以抑 制表达KRAS G12C，G12D或G12V突变的BaF3细胞增殖，平均IC50约为140nM。研究者决定进一步研究BI-2865及其相关化合物的影响，将它们称为泛KRAS抑 制剂或KRASi。

图1：与KRASi结合的KRAS WT，G12C，G12D，G12V和G13D突变体的共晶体结构

为进一步探究该抑 制剂的作用原理，研究者使用均相时间分辨荧光测定法（HTRF法）来测量核苷酸交换。将抑 制剂以10μM的三倍连续稀释至十种不同的浓度测试，并使用Echo声波移液系统转移到反应孔中。

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数据表明，无论收到核苷酸交换因子SOS1或EDTA的刺激时，结合GDP的KRAS突变体在结合抑 制剂后，依赖核苷酸交换的激活有所降低。该抑 制剂仅在高浓度（平均IC50约为5.5μM）下阻止效应子与活性KRAS结合，并且低亲和力的结合不会导致KRAS-GTP水解增强。相比之下，非活性状态结合对核苷酸交换的抑 制作用的IC50约为5nM。数据表明，该抑 制剂在细胞中的抑 制活性主要依赖于靶向KRAS的非活性或GDP结合状态。

图2：KRASi处理对SOS1（d）或EDTA（e）刺激的核苷酸交换的影响

在上述实验中可以看到抑 制剂通过HRAS或NRAS抑 制核苷酸交换的能力比KRAS低几个数量级。由于RAS亚型的GTP酶（G）结构域的进化分歧很小，只有很少的非同源氨基酸存在。因此，为了确定KRAS选择性的基础，研究者对比了HRAS，NRAS和KRAS之间的氨基酸差异。实验表明，在RAS亚型的G结构域中具有进化分歧的3个残基（Q95H/A121P/A122S）也对KRAS抑 制施加了选择性限制。虽然仅限于几个氨基酸，但RAS的GTP酶结构域的进化分歧亚型足以赋予KRAS 选择性的正构和别构约束。

接下来，研究者们评估了泛KRASi在一组39个细胞系中抑 制KRAS激活和下游信号传导的能力。这些细胞系起源于肺癌，结直肠癌或胰 腺癌。首先将细胞接种在黑色384孔组织培养板中培养24小时，测定ATP浓度。然后使用Echo声波移液系统转移KRASi至培养板中，继续培养5天后再次测定ATP浓度。正如生化数据所预期的那样，KRASi抑 制了WT和突变模型中的KRAS激活。

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为了评估KRASi对下游信号传导的影响，并鉴定KRAS失活后立即失调的转录本和路径，研究者在使用DMSO或KRASi处理的22个模型中进行了RNA测序。KRASi处理后差异表达的基因在KRAS突变模型之间相似，KRASi处理会抑 制MEK/ERKi下调基因，同时诱导MEK/ERKi上调基因。与WT KRAS相比，这种效应在表达KRAS突变体的细胞系中更为明显。数据表明，KRAS WT模型中缺乏下游信号抑 制可能是由于HRAS和NRAS的补偿。

研究团队针对体内给药对BI2865进行了优化，BI-2493是BI-2865的结构类似物，两种泛KRASi与突变KRAS具有相似的结合模式和抑 制特性。体内研究表明，BI-2493抑 制剂减弱了携带KRAS G12C，G12D，G12V和A146V突变模型的小鼠的肿瘤生长，而不会对小鼠造成明显的毒性。

图3：选择性抑 制肿瘤信号传导和KRAS驱动的肿瘤生长

综上所述

这篇研究报告了一种泛KRAS抑 制剂，该抑 制剂通过优先靶向KRAS的非活性状态来防止其通过核苷酸交换重新激活。泛KRAS抑 制剂的细胞效应表明，对非活性状态选择性抑 制的敏感性，并不是仅针对KRAS G12C突变体，而是可以应用于广泛靶向KRAS突变体的特性，后者包括G12A/C/D/F/V/S、G13C/D、V14I、L19F、Q22K、D33E、Q61H、K117N和A146V/T，它们共同构成了癌症中发现的大部分KRAS突变体。这一研究为开发更多KRAS靶向疗法提供了蓝图，包括GTP结合KRAS的小分子抑 制剂和蛋白水解靶向嵌合体。