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YIJI线粒体呼吸链复合物V活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

YIJI线粒体呼吸链复合物V（F0F1-ATP酶/ATP合成酶）活性光谱法定量检测试剂是一种旨在使用丙

酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定与ATP合成对应的ATP水解产生ADP过程中，伴随的

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光谱法测定样品中酶活性的权威

而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动

物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的F0F1-ATP酶/ATP合成酶的特异性活性检测。可用于心

肌、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，

操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物V，通常称为ATP合成酶（ATPsynthase）F型ATP酶typeATPase）、（F和F1F0ATP酶（F1F0

ATPase），是线粒体氧化磷酸化的反应。其分子量为500KD，含有十六个亚单位，其中两个：ATP酶6

和8为线粒体DNA编码的。ATP酶主要有两个结构域：F0为质子通道，由几个膜蛋白构成，包括a、b、c、d、

e、F6、A6L、OSCP（oligomycinsensitiveconferringprotein）等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β

3γδε蛋白构成。其Z特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。复合物V的主要功能在于产生大部分

细胞所需的能量ATP。ATP的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时，呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。

质子通过F0结构域传递到基质，激活F1催化活性结构域，促使ATP合成。该酶异常会导致心肌和神经系统

疾病。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F1F0ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvatekinase；PK）

和乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reducednicotinamide

adeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide；NAD），

产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析F1F0ATP酶活性。其反应系统为：

产品内容

YIJI缓冲液（ReagentA）

YIJI反应液（ReagentB）

YIJI阴性液（ReagentC）

YIJI底物液（ReagentD）

YIJI专性液（ReagentE）

产品说明书

毫升

毫升

毫升

微升

微升

1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI反应液（ReagentB），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于光谱分析的容器

1

分光光度仪：用于光谱分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI反应液（ReagentB）注

意避光。然后进行下列操作。

一、测定准备

1．准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里（注意：检测前溶解线粒体；参见注意事项4）

2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔30秒，读数11次（共5分钟），并置零

二、背景对照测定

1．移取xx微升YIJI缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升YIJI反应液（ReagentB）

3．加入xx微升YIJI底物液（ReagentD）

4．放进30℃培养箱里孵育3分钟

5．加入xx微升YIJI阴性液（ReagentC）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟

三、样品总活性测定

1．移取xx微升YIJI缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升YIJI反应液（ReagentB）

3．加入xx微升YIJI底物液（ReagentD）

4．放进30℃培养箱里孵育3分钟

5．加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项4）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟

四、样品非特异活性测定

实验开始前，移取100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项4）到1.5

毫升离心管，加入xx微升YIJI专性液（ReagentE），混匀后，放进30℃培养箱里孵育15分钟。然

后置于冰槽里备用

1．移取xx微升YIJI缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升YIJI反应液（ReagentB）

3．加入xx微升YIJI底物液（ReagentD）

4．放进30℃培养箱里孵育3分钟

2

5．加入120微升上述预处理的待测样品

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数1分钟或5分钟

五、计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

【（样品读数－背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0xx（样品容量；毫升）Xxx（毫

摩尔吸光系数X1或5（反应时间，分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔NADH/分钟

2）样品特异活性

样品总活性测定－样品非特异活性测定＝样品特异活性

注意事项

1．本产品为21次操作（10个样本），包括1次背景对照

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．线粒体样品检测前，须溶解；建议超声处理（20秒X3循环；50％功率）或冻存融解（－70℃至37℃）

循环3次或使用YIJI线粒体溶解试剂盒－GMS10018

5．建议线粒体悬液使用0.25MSUCROSE和2mMEDTA，pH9.0；忌用磷酸缓冲溶液

6．建议使用线粒体裂解悬液，而不是细胞裂解悬液。如果使用细胞裂解悬液，**须澄清；第二须加50

微克

7．加入样品后3秒内即刻光谱测定

8．反应1分钟后光谱测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

9．测定值由高到低变化，即0分钟测定读数高于1分钟或5分钟测定读数，表明有酶活性

10．光谱测定后，比色皿须清洗彻底

11．建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样

本量；注意计算公式的调整（本公司提供YIJI线粒体溶解试剂盒GMS10018为后续的线粒体蛋

白浓度测定的预处理试剂盒和YIJIBradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

12．样品特异活性是指寡霉素敏感的ATP合成酶，去除其它干扰因素（例如复合物I/II/III/IV等）

13．线粒体呼吸链复合物V酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH7.5条件下，每分钟内能够氧化1微

摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

14．本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测准确