临床样本中类固醇激素前处理解决方案-SPE
类固醇激素,又称甾体激素,是一类四环脂肪烃化合物,具有环戊烷多氢菲母核,因其在维持生命、调节性功能、对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面的作用,临床表征中经常会作为疾病诊断的参考,因此,相关激素在临床样本中准确的定性和定量分析就变得尤为重要。在上周的推文中,我们分享了用LC-MS/MS方法检测临床19种类固醇激素的解决方案,该方案的完整执行,离不开合适的前处理基础,这周我们就为大家分享其中一种基于SPE的前处理方法。
整个SPE方案的考察过程中,我们对淋洗和洗脱方案进行了相应优化。对于淋洗方案,首先尝试了甲醇与水的不同比例,从10%的甲醇/水增加到90%的甲醇/水,其中Z好的结果为30%甲醇/水的比例。而后接着尝试了两种洗脱方案,第一种为1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗,第二种为30%甲醇/水淋洗后采用正己烷淋洗。对于所有淋洗方案来说,1%甲酸水淋洗后采用30%甲醇/水淋洗的方式回收率Z佳。在洗脱方案中,同样进行了一些尝试,Z终决定采用甲醇:乙腈(1/4)进行洗脱。以下为优化后的SPE方案:
步骤 | 操作 |
样品预处理 | 500μL血清样本与500μL 1%甲酸水混合 |
活化 | 1mL甲醇活化Strata-X, 33μm聚合物反相,30mg 96孔板(货号: 8E-S100-TGB) |
平衡 | 1mL水 |
上样 | 1mL预处理后的样品(10μL内标) |
淋洗1 | 1mL 1%的甲酸水溶液 |
淋洗2 | 1mL 30%的甲醇/水溶液,真空抽干 |
洗脱 | 2X500μL甲醇:乙腈(1:4, V:V) |
氮吹浓缩 | 45℃ |
复溶 | 100μL 0.5mM的氟化铵水溶液/甲醇(60:40, V:V)溶液 |
图3 Kinetex C18分离类固醇相关异构体总离子流图
图4 部分化合物标准曲线
表3 标准曲线,LLOQ和S/N结果汇总
Kinetex 2.6μm C18色谱柱在正离子和负离子模式下能对分析物提供8分钟之内的高选择性分析结果(见图3)。具有相同质荷比的异构体也完成了分离。标准曲线线性良好,分析物R2均大于0.99(见表3)。三种浓度下的三份加标样品的准确度为80%~120%。除DHEAS回收率为54%之外,其他所有分析物的低浓度加标样品的回收率为81%~116%;除DHEAS回收率为61%之外,所有其他分析物中浓度加标样品的回收率为80%~96%;除DHEAS回收率为59%之外,所有其他分析物高浓度加标样品的回收率为82%~102%(见表4)。要提高DHEAS的回收率,就要采用不同的洗脱方案。分析物的加标样品精密度(%RSD)均小于15%(见表5)。
PS: pre-spiked samples
PoS: post-spiked samples
表4 回收率及准确度结果
表5 精密度,基质效应和方法回收率结果
根据实验结果,上述方法可作为血清中类固醇激素分析的一种高效、重现性良好的前处理方法。使用Strata-X 96孔板可以作为有效净化手段,同时采用Kinetex 2.6μm C18, 50x3.0mm色谱柱可在8分钟内对相关类固醇分析物进行有效分离,同时对异构体进行分离从而实现准确定量。
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