mRNA-LNP的结构到底是怎样的?
mRNA-LNP无疑是近两年Z火热的研究热点,随着新冠疫情的不断肆虐,几款采用了mRNA-LNP的新冠疫苗陆续上市,使人们对这一具有广泛应用前景的技术愈发重视。那么对于一个制备良好的mRNA-LNP,其内部分子组成结构到底是怎样的呢?今天小编就通过相关研究带大家一起探索其组成结构。 首先,目前普遍采用的mRNA-LNPCF多是通过由阳离子磷脂、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)、胆固醇、DMPE-PEG2000(磷脂酰yi醇胺-聚yi 二醇2000)构建的LNP来实现对mRNA分子的包载。几种磷脂分子发挥各自的功效将mRNA分子包裹在内部形成一个球形的脂质纳米粒,而且通过CF的调整,也可以实现粒径大小不同的LNP制备,详见图1电镜图。
图1. LNP的冷冻透射电镜图,a、b、c分别为粒径大小在48nm、64nm、100nm左右的LNP
随后采用小角中子散射技术来进一步研究LNP上的磷脂分子分布情况,利用氘化的DSPC和胆固醇进行LNP的制备,并分别在不同比例下的D2O/H2O缓冲液中检测其散射信号。结果如图2A,散射信号只在缓冲液中D2O较低时检测到,即在q ∼ 1 nm−1处有一明显的峰。而DSPC的散射长度密度(SLD)和其他磷脂材料有ZD的区别,这些散射曲线都与之前报道过的核-壳结构体系的小角散射的结果相似,而且图中的数据拟合与一核两层壳的结构Z为吻合。图2B中的散射长度密度数据则可代表LNP外壳到ZX的距离,图2C则是根据散射结果分析后得到的LNP结构的模型示意图。在此模型中,我们认为LNP的核由阳离子磷脂、胆固醇、mRNA和水组成,在此核的外部是一层2.4 nm厚的由DSPC,少部分的阳离子磷脂、胆固醇以及PEG磷脂中的DMPE端组成的单层壳。再向外则是一层约4 nm厚的PEG磷脂壳。
图2. (A)不同D2O含量下的LNP小角中子散射结果,从上至下分别为18%、27%、50%、68%、100%的D2O。(B) SLD曲线作为LNPZX距离的函数,与A中数据的拟合相对应。(C) 根据SLD数据描绘的LNP中脂质分布示意图
同时,根据LNP主要成分的SLD数据,详见表1,可以详细验证LNP系统的组成。溶剂的SLD由H2O/D2O的比例给出,PEG层的SLD随着它延伸到溶剂中而变化。在LNP中,内核的SLD是恒定的,但随着D2O含量的变化而变化。mRNA的SLD也随着D2O体积分数的增加而增加,因为它含有可以交换为氘的不稳定氢。利用拟合的内核SLD值作为D2O含量的函数,以及LNP组分已知的SLD值(表1)与建立的脂质:mRNA摩尔比,根据以下公式可以计算LNP中的水含量。其中V是各成分的体积分数。
VDLin-MC3-DMA · SLDDLin-MC3-DMA + VChol · SLDChol+ VH2O · SLDH2O +VRNA · SLDRNA =SLDcore
脂质单层的SLD不依赖于溶剂而保持恒定,这证实了如预期的那样,该层中没有溶剂存在。由阳离子磷脂(DLin-MC3-DMA)、DSPC、胆固醇、PEG磷脂中的DMPE段包裹在核心外。 目前这一mRNA-LNP的结构也是目前比较公认的一种结构,但是通过相关研究可以进一步为我们提供强有力的科研依据。几种脂质成分不是均匀的随意分布在LNP上的,其结构信息也会给研究者们提供更多的灵感,以帮助他们设计研发更加合理有效的mRNA-LNP出来。
参考文献:
1. Zackrisson M, et al. (2005) Small-angle neutron scattering on a core-shell colloidal system: A contrast-variation study. Langmuir 21:10835–10845
2. Belliveau NM, et al. (2012) Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids 1:e37.
3. Marianna YA, et al.(2018)Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. PNAS 115: E3351–E3360
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