Horizon文献速递 | Nature教你一文搞懂基因沉默筛选

来源：珀金埃尔默医学诊断产品(上海)有限公司分类：商机 2024-02-02 08:45:11 55阅读次数

基因功能研究一直是科学研究的核心内容，科学家们往往先发现表型，再去研究机制，那么如何从表型出发发现相关的基因呢？高通量基因筛选应运而生。在基因筛选实验中，RNA干扰（RNAi）仍然是Z简单有效的筛选方法。通过合成小干扰 RNA（siRNA）进行RNA干扰更是基因筛选研究的首选。

今天小编带大家快速学习一篇Nature paper，看看siRNA基因沉默筛选如何开展，及Z终如何发现病毒自噬新机制。

背景

细胞使用自噬来降价不需要的物质。自噬过程首先将不需要的物质隔离在自噬小体（autophagosome）中，然后自噬小体与溶酶体融合，将里面的物质降解为构成单元（building block），比如氨基酸，并将它们回收用于其他用途。

自噬物质包括旧的或有缺陷的细胞器和蛋白、细菌和病毒入侵者。科学家们已经基本确定了细胞启动和调节自噬的途径。然而，迄今为止还不清楚，是否有一条独特的途径专门针对病毒进行自噬。

研究过程

为了寻找针对病毒的自噬途径，首先开展了全基因组siRNA基因沉默筛选：

初筛基于自噬小体的点状表型（GFP-LC3标记）：使用两种病毒SIN或HSV-1ΔBBD感染 HeLa/GFP-LC3细胞后，细胞会产生GFP-LC3自噬小体点。作者分别用这两个感染体系来进行筛选，使用了Dharmacon siGENOME siRNA全基因组文库，通过成像检测LC3点的数量，选择那些沉默后导致病毒诱导自噬小体点减少的基因，且排除了那些有明显细胞毒性（细胞生长异常）或者影响生理性自噬的基因，初筛共获得了310个潜在阳性基因；

验证性筛选（去卷积筛选）基本重复了这一过程，使用了Dharmacon Cherry-pick siGENOME library siRNA set of 4，仅有>=2条siRNA能重复出表型的基因被筛选出来，共筛选出来216个阳性基因，其中两种病毒感染体系的交集有154个基因；

展开生物信息学分析，确定了分子功能相关的阳性基因集，再考虑到大多数病毒通过细胞内吞作用侵入细胞，Z终选定SNX5（sorting nexin 5）作为进一步研究的对象。SNX5是一种细胞内吞体蛋白，包含两段重要的结构域：一段可与磷酸肌醇（如 PtdIns(3)P）结合的PX结构域；一段感知、驱动膜结构弯曲的BAR结构域。

在其他病毒中进一步验证SNX5的效果：

细胞和小鼠的病毒感染实验表明，siRNA沉默后SNX5后抑制了寨卡病毒（Zika virus）、西尼罗河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒(CHIKV) 八种来自五个差异巨大的病毒科的人类病毒的感染后自噬；

免疫共沉淀实验分析SNX5的相互作用蛋白：

SNX5与PI3KC3-C1发生相互作用进而激活细胞自噬，两者间相互作用无需PI3KC3-C1脂质激酶激活，提示SNX5作用于PtdIns(3)P上游；

细胞定位实验分析SNX5蛋白功能：

荧光标记病毒侵染细胞后发现SNX5选择性募集到有病毒颗粒的内吞体表面，而BAR突变型SNX5不会出现募集。BAR结构域内带正电基团可通过静电作用介导带BAR结构域的蛋白与双层脂质结构相互作用，提示SNX5通过BAR结构域提高膜的曲率来活化自噬相关的PI3KC3-C1激酶复合体，从而激活自噬。

验证SNX5自噬通路是否是病毒诱导特异性的：

siRNA沉默囊泡转运复合体基因VPS29并检测葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）逆向转运功能，VPS29敲减后囊泡转运复合体功能发生障碍但病毒诱导自噬未受影响。另一方面，SNX5KO HeLa细胞转铁蛋白受体回收循环动力学和表皮生长因子降解效率均未受影响，提示SNX5敲除不影响早期及晚期细胞内吞活动。

讨论

这些结果共同表明，细胞确实有一条独特的病毒自噬途径，该途径是由SNX5控制的。这一新发现填补了细胞生物学、病毒学和自噬学中一个重要基础知识的空白，并为基于自噬调控的广谱抗病毒治疗策略和药物的研发提供了重要的基础。

这篇研究全篇使用了Dharmacon的siRNA文库，Dharmacon siRNA产品有如下特点：

SMARTselectionTM技术?高度特异性，确保沉默效率
我们使用SMARTselection? 技术设计高质量siRNA，该技术涵盖一整套完整而严密的设计算法，针对每个基因投放效果Z好的4条siRNA至Z终的产品中。

SMARTpoolTM技术?无需验证，保证至少75％靶基因沉默效率
我们通过SMARTpoolTM技术更好的模拟内源RNAi通路，将针对同一靶基因的4条siRNA混合成为一管试剂，保证更高效的基因沉默效率。同时，由于每条siRNA的浓度相对降低而减少了脱靶效应（off-target），增强实验数据的真实性。

双链修饰技术，有效减少off-target并进一步提升沉默效率
siRNA是双链结构，Z主要的脱靶效应是由反义链中“seed region”活性引起的，此外，正义链也有可能引起脱靶。我们拥有专利的双链修饰技术，对正义链和反义链同时进行修饰，能够有效的减少脱靶效应90%以上，同时抑制miRNA-like作用，并能有效减少细胞的生长抑制，保证沉默效率的同时防止假阳性。

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产品名称	特点
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siGEMONE siRNA文库	历史Z悠久且应用Z多的siRNA试剂，在高效靶基因沉默方面广受认可和信赖
Accell siRNA文库	无需转染试剂、病毒或电穿孔，即可将siRNA送入难以转染的细胞，因此是难转染细胞筛选的唯一选择
DharmaFECT 1, 2, 3, 4转染试剂	专业的小RNA转染试剂，能以低浓度和低细胞毒性实现siRNA和microRNA试剂的有效转染