默克生命科学为您总结如何选择液相色谱分离模式
自 1903 年,俄国植物学家米哈伊尔•茨维特发明色谱算起,色谱已走过 100 余年历程。从Z早正相色谱法,发展至今,诸多液相色谱分离模式:反相分离模式、亲水分离模式、离子分离模式、体积排阻分离模式和亲合分离模式等。因其具备多功能性和极ng确性,作为定性和定量的工具,液相色谱分析方法广泛应用于各行各业,如药物质量控制、食品营养物质和添加剂检测、环境挥发性有机物检测、法医毒物司法鉴定、临床质谱代谢物监控与高性能材料配方测定等。
了解和理解液相色谱分离模式,有助于液相色谱分析相关工作的开展和深入。
图1.色谱鼻祖
米哈伊尔•茨维特,俄国植物学家
液相色谱分离机理,本质上是分析物在流动相与固定相之间作用力差异。对于样品分析,需要综合组分性质与分离目的,选择合适的分离模式,便于获取**分析结果。对于分离模式,简介如下:
1.正相分离模式(Normal Phase)
茨维特发明色谱的植物色素分离实验,即采用正相分离模式。
机理:组分在极性固定相上的吸附/解吸附过程。
正相之意源自固定相极性大于流动相极性。
固定相以硅胶/氧化铝居多;流动相包括正己烷、石油醚、二氯甲烷、异丙醇等非极性和弱极性溶剂。
适合非极性与弱极性化合物分离、异构体分析、复杂样本分级以及特殊组分净化等。
正相分离模式下容易在极性填料表面产生死吸附,导致较差的重现性;目前主要用于手性拆分和制备色谱。
如脂溶性维生素D2分析与维生素D组分净化(GB 5009.82-2016 第四法食品中维生素D的测定):
图2.维生素D₂纯度分析-正相分离模式
2.反相分离模式(Reversed Phase)
机理:组分在疏水固定相与极性流动相之间分配差异(疏水相互作用)。
反相之意源自固定相极性小于流动相极性。
反相分离模式因其分辨率高、平衡速度快等优势,在所有液相分离模式中占据主要地位(约70%样品分析采用反相分离模式)。
图3.反相分离模式适用小分子、大分子和手性分子拆分
固定相以疏水功能基团(C18/C8)键合填料居多;流动相包括水相(纯水与缓冲液)、甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃等极性和中等极性溶剂。
适合极性化合物(耐纯水反相填料,在高比例水相条件下,可实现令人满意的保留和基线分离)、中等极性、弱极性和部分非极性化合物分离分析。
注意:对于部分可离子化组分分析,可通过添加离子对试剂的方式,进行反相分析。
图4.磷酸氯喹系统性实验谱图
3.亲水分离模式(HILIC)
机理:组分在流动相与固定相表面富水层之间分配差异。
固定相以极性基团键合填料居多;流动相包括水相(纯水与缓冲液)、甲醇、乙腈等极性与中等极性溶剂。
固定相与正相分离模式一致,流动相组成包含有机相和水相,故有含水正相的别称。又因分离模式中作用力较多,国内色谱理论界大拿至今不认可其作为单独分离模式划分。
亲水分离模式起步较晚,但因其适合极性化合物分离分析,随着生命科学迅速发展,应用范围逐步扩大,目前成为高极性化合物分析的重要手段。适用于极性化合物(如草甘膦、极性代谢物和糖链)、无机离子和亲水肽段等。
图5.亲水分离模式下6种极性化合物分离谱图
4.其他分离模式
离子分离模式(Ion-Exchange),基于离子化合物与固定相离子化功能基团之间离子相互作用。适合离子化化合物的分析,如无机离子、氨基酸、有机酸、聚核苷酸和蛋白电荷异构体等。
注意:3价离子不适合用离子分离模式进行分析,因其与固定相作用力过强,出现不保留或强保留甚至不出峰的情况。
体积排阻分离模式(Size-Exclusion),利用不同分子量组分在填料内流经路径差异,实现分离。适用于低聚物组成、高分子化合物分子量测定与分布分析等。近年来在抗体药物单聚体与多聚体分析、PEG偶联分析等方面表现出zhuo越性能。
注意:该分离模式对于小分子之间的分析,分辨率极低,即使组分分子量差异在5倍以上。
亲合分离模式(Affinity),利用受体与配体之间可逆特异性结合(复杂作用力),实现分离。经典应用,即是利用Protein A与IgG的Fc区域之间的亲合作用,将Protein A键合在填料上,实现IgG类蛋白药物的纯化和浓度滴定。
亲合分离模式(Affinity),利用受体与配体之间可逆特异性结合(复杂作用力),实现分离。经典应用,即是利用Protein A与IgG的Fc区域之间的亲合作用,将Protein A键合在填料上,实现IgG类蛋白药物的纯化和浓度滴定。
离子分离模式、体积排阻分离模式(凝胶过滤)与亲合分离模式,流动相均为含盐缓冲液,可保证蛋白活性,特别适用于生物制药行业。
小 结
液相色谱分析中,会遇到各种样品组分,充分考虑分子性质和分析目的等方面信息,选择合适的分离模式。一般来讲,
• 对于小分子分析反相分离模式;
• 对于极性化合物分析,可高比例水相条件下的反相分离模式,其次亲水分离模式。
• 对于大分子分析,可选择的分离模式较多, 反相、离子、体积排阻、亲合与疏水等。
• 对于手性分子,尤其慎重选择填料和分离模式。
色谱包括液相色谱是一门经验科学,用心思考,善加总结,随着时间的积累,会加深对色谱的理解,综合考虑各方面因素,拿出Z好的实验方案。
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