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- 【导读】谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase,GR)说明书分光光度法50管/48样注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义:GR是广泛存在于真核...
谷胱甘肽还原酶(glutathionereductase,GR)说明书
分光光度法50管/48样
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH,有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。
测定原理:
GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH,同时NADPH脱氢生成NADP+;NADPH在340nm有特征吸收峰,相反NADP+在该波长无吸收峰;通过测定340nm吸光度下降速率来测
定NADPH脱氢速率,从而计算GR活性。
自备仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水
试剂组成和配置:
试剂一:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入5.0mL蒸馏水,混匀。
试剂三:液体3mL×1支,4℃保存。
粗酶液提取:
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心15min,取上清,置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心15min,取上清置于冰上待测。
3.血清等液体:直接测定。
操作步骤:
1.分光光度计预热30min,调节波长到340nm,蒸馏水调零。
2.试剂一置于25℃(普通物质)或者37℃(哺乳动物)中预热30min。
3.测定管:取1mL石英比色皿,依次加入50μL试剂三,100μL试剂二,750μL试剂一,
100μL上清液,迅速混匀,于340nm测定10s和190s吸光度,记为A测1和A测2,△A
测定管=A测1A测2。(注意加完上清液后迅速混匀测定)
计算公式:
(1).按蛋白浓度计算
活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。
GR酶活(nmol/min/mgprot)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷[Cpr×V样]÷T
=536×△A测定管÷Cpr
(2).按样本质量计算
活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每克样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为
1个酶活单位。
GR酶活(nmol/min/g鲜重)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=536×△A测定管÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每104个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。
GR酶活(nmol/min/104cell)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=536×△A测定管÷细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义:在一定温度中,pH8.0条件下,每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。
GR酶活(nmol/min/mL)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷×V样÷T
=536×△A测定管
ε:NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm;V反总:反应体系总体积,1000μL=0.001L;
106:1mol=1×106μmol;Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,
3min。
注意事项:
(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;(2)试剂二须现配现用,配制完后,置于冰上,未使用完的4℃保存,三天内使用完。(3)测定前须先用1~2个样做预实验,哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2~5倍。
(4)细胞中GR活性测定时,细胞数目须在300万-500万之间,细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞
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- 2004-09-12 09:23:03
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