谷胱甘肽还原酶（glutathione ）说明书

谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase,GR）说明书

分光光度法50管/48样

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。

测定原理：

GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测

定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿和蒸馏水

试剂组成和配置：

试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入5.0mL蒸馏水，混匀。

试剂三：液体3mL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。

3.血清等液体：直接测定。

操作步骤：

1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2.试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min。

3.测定管：取1mL石英比色皿，依次加入50μL试剂三，100μL试剂二，750μL试剂一，

100μL上清液，迅速混匀，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2，△A

测定管=A测1A测2。(注意加完上清液后迅速混匀测定)

计算公式：

(1).按蛋白浓度计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mgprot)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷[Cpr×V样]÷T

=536×△A测定管÷Cpr

(2).按样本质量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样本每分钟催化1nmolNADPH氧化为

1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/g鲜重)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=536×△A测定管÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每104个细胞每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/104cell)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=536×△A测定管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫升液体每分钟催化1nmolNADPH氧化为1个酶活单位。

GR酶活(nmol/min/mL)=[△A测定管÷ε÷d×V反总×109]÷×V样÷T

=536×△A测定管

ε：NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm；V反总：反应体系总体积，1000μL=0.001L；

106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，

3min。

注意事项：

（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；（2）试剂二须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的4℃保存，三天内使用完。（3）测定前须先用1～2个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2～5倍。

（4）细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞

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