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线粒体复合体Ⅱ试剂盒说明书
分光光度法25管/24样测定意义
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。测定原理
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。需自备的仪器和用品
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。试剂组成和配制
试剂一:25mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:5mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:0.5mL×1支,-20℃保存;试剂四:液体25mL×1瓶,4℃保存;试剂五:粉剂×1支,-20℃保存;试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;试剂七:液体2.5mL×1瓶,4℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做)。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅱ酶活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计预热30min以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:临用前把试剂五和试剂六转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在1mL玻璃比色皿中加入40μL样本、100μL试剂七和800μL工作液,立即混匀,记录605nm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
复合体Ⅱ活力单位的计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(U/mgprot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=559×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=113×ΔA÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。复合体Ⅱ活力(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.226×ΔAV反总:反应体系总体积,9.4×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
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- 2004-09-12 09:23:03
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