- 可恶!知识不受控制的进入了我的大脑!
- Dr.赛流式小课堂 | 轻松上手流式染色细胞因子实验
- 小道快讯 | 交付中心技能PK大赛奖项花落谁家
- MP工具箱 | 云学堂:一键开启免费学习平台
- 媒体报道丨国产仪器如何跑赢存量市场?
- 东隆科技诚邀您共赴CIOE 2024深圳光博会,见证光电技术革新!
- 滨松:行“专业公司”应行之事
- 参会指南 | 第一届微纳塑料检测及其标准化学术研讨会
- 8月节日 | 为猫咪、狗狗和流浪动物送上专属礼物
- 实验室磷酸根分析仪有效检测磷酸根含量高低
- Aiculture|探索微生物世界:平板计数琼脂的实用指南
- 火力发电|教科书里的奥立龙在线钠表
- 啤酒色度仪如何检测啤酒色度值?
![上海长方光学仪器有限公司](http://yiqi-oss.oss-cn-hangzhou.aliyuncs.com/aliyun/Manage/2018-07-06/20180706-2055212137.jpg)
- 来源:内容来源于网络 浏览量:1041次
- 【导读】蛋白质免疫印迹(WesternBlot)实验方法原理:Western免疫印迹(WesternBlot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体...
蛋白质免疫印迹(WesternBlot)
实验方法原理:
Western免疫印迹(WesternBlot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似,但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针"是抗体,“显色"用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料:蛋白质样品
试剂:试剂盒丙烯酰胺SDSTris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒(青岛捷世康生物科技有限公司提供)。
仪器:耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒
实验步骤:
一、试剂准备
1.SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2.匀浆缓冲液:1.0MTris-HCl(pH6.8)1.0ml;10%SDS6.0ml;β-巯基乙醇0.2ml;ddH2O2.8ml。
3.转膜缓冲液:甘氨酸2.9g;Tris5.8g;SDS0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。
4.0.01MPBS(pH7.4):NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;加ddH2O至1000ml。
5.膜染色液:考马斯亮兰0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。
6.显色液:DAB6.0mg;0.01MPBS10.0ml;硫酸镍胺0.1ml;H2021.0μl。
二、蛋白样品制备:
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取
(1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。
(2)每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS(0.01MpH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(3)按1ml裂解液加10μlPMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)
(4)每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
(5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片
和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)
(6)于4℃下12000rpm离心5min。(提前开离心机预冷)
(7)将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于-20℃保存。
2.组织中总蛋白的提取
(1)将少量组织块置于1~2ml匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
(2)加400μL单去污剂裂解液裂(含PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。
(3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。
(4)裂解30min后,即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中,然后在4℃下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取
由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:
(1)将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min。
(2)弃上清,加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤,然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。
(3)用枪洗干上清后,加100μL裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
(4)将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20℃保存。
三、蛋白含量的测定
1.制作标准曲线
(1)从-20℃取出1mg/mlBSA,室温融化后,备用。
(2)取18个1.5ml离心管,3个一组,分别标记为0mg,2.5mg,5.0mg,10.0mg,20.0mg,40.0mg。
(3)按下表在各管中加入各种试剂。
(4)混匀后,室温放置2min。在生物分光光度计(Bio-Photometer,Eppendorf)上比色分析。
2.检测样品蛋白含量
(1)取足量的1.5ml离心管,每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。
(2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100ml,混匀放置2分钟可做为空白样品,将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
(3)弃空白样品,用无水乙醇清洗比色杯2次(每次0.5mL),再用无菌水洗一次。
(4)取一管考马斯亮蓝加95ml0.15mol/LNaClNaCl溶液和5ml待测蛋白样品,混匀后静置2min,倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意:每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次,无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测,这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5ml样品含的蛋白量。
四、SDS-PAGE电泳
1.清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2.灌胶与上样
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。)
(2)按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。)
(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。)
(6)测完蛋白含量后,计算含50ng蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中,加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15μl,加样孔的Zda限度可加20μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
(7)加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
3.电泳
电泳时间一般4~5h,电压为40V较好,也可用60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
五、转膜
1.转一张膜需准备6张7.0~8.3cm的滤纸和1张7.3~8.6cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
2.在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3.将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4.要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。(撬时一定要小心,玻板很易裂。)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。Z后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,
接触后会发生短路。(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。)
5.将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移2h或40V转移3h。
6.转完后将膜用1×丽春红染液染5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。
六、免疫反应
1.将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2.将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中);撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBS洗一次,10min。
3.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;再用TBS洗一次,10min,进行化学发光反应。
七、化学发光,显影,定影
1.将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
2.在暗室中,将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达Z佳效果;曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影时间一般为5~10min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。
应注意的是:显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
八、凝胶图象分析
将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。收起
注意事项
1.一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定Z佳条件。
2.显色液必须新鲜配置使用,Z后加入H2O2。
3.DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。
展开
其他一、免疫反应
1.用0.01MPBS洗膜,5min×3次。
2.加入包被液,平稳摇动,室温2h
3.弃包被液,用0.01MPBS洗膜,5min×3次。
4.加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃放置12h以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。
5.弃一抗和1%BSA,用0.01MPBS分别洗膜,5min×4次。
6.加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释),平稳摇动,室温2h。
7.弃二抗,用0.01MPBS洗膜,5min×4次。
8.加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
相关热词:
等离子清洗机,反应釜,旋转蒸发仪,高精度温湿度计,露点仪,高效液相色谱仪价格,霉菌试验箱,跌落试验台,离子色谱仪价格,噪声计,高压灭菌器,集菌仪,接地电阻测试仪型号,柱温箱,旋涡混合仪,电热套,场强仪万能材料试验机价格,洗瓶机,匀浆机,耐候试验箱,熔融指数仪,透射电子显微镜。
- 2004-09-12 09:23:03
- 标签:
- 收藏(0) 赞(0) 踩(0)
-
随时了解更多仪器资讯,求购、招标、中标信息实时更新,厂商招商信息随时看。大量、齐全、专业的仪器信息尽在仪器网(yiqi.com)。扫一扫关注仪器网官方微信,随时随地查看仪器用户采购、招标需求!
-
江林蛋白质免疫印迹(Western blotting)服务2004-09-11 09:23:05
简介:分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法提供商:上海江林生物科技有限公司服务名称:West
-
免疫印迹法检测人类免疫缺陷病毒2004-11-06 09:23:05
[测定方法]免疫印迹法(或蛋白印迹法)[方法学原理]将纯化的确诊HIV蛋白抗原裂解,然后通过SDS-PAGE
-
免疫印迹技术和免疫斑点技术2004-11-06 09:23:05
免疫印迹技术又称Western印迹法,它将凝胶电泳与固相免疫结合,首先通过蛋白质电泳技术将需要区分的蛋白质转
-
Western Blot wb免疫印迹检测课题技术服务2004-11-23 09:23:21
关键词:WesternBlotwb免疫印迹检测课题技术服务|实验技术服务简介:世界顶尖品牌WesternBl
-
Western Blot wb免疫印迹检测课题服务2004-11-23 09:23:21
关键词:WesternBlotwb免疫印迹检测课题服务|实验技术服务简介:世界顶尖品牌WesternBlot
-
Western Blot wb免疫印迹检测课题|实验技术服务2004-11-23 09:23:21
关键词:WesternBlotwb免疫印迹检测课题|实验技术服务简介:世界顶尖品牌WesternBlotwb
-
Western 免疫印迹具体操作说明书2004-11-29 09:23:26
Western免疫印迹具体操作说明书上海恒远生物代做Western免疫印迹实验操作,欢迎来电咨询关于实验的有
-
Western Blot免疫印迹 蛋白印迹实验服务2004-12-08 09:23:04
WesternBlot免疫印迹蛋白印迹实验服务免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(wes
-
免疫印迹原理、步骤及注意事项2004-08-16 09:23:04
北京索莱宝科技有限公司1Westernblot原理通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色
-
免疫印迹封闭液2004-08-29 09:23:07
在WB实验过程中,我们常常会提到封闭液的使用问题。我们会使用到封闭液的原因是因为在电泳转膜后,膜上其它没有结
蛋白免疫印迹实验
-
您可能感兴趣
![](https://static.yiqi.com/Pingce/img/imgddd.png)
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布,观点仅代表作者本人,不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们立即通知作者,并马上删除。
②凡本网注明"来源:仪器网"的所有作品,版权均属于仪器网,转载时须经本网同意,并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品来源,并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益,请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱:hezou_yiqi