荧光定量PCR具体使用操作 折叠 样品RNA的抽提 折叠 RNA质量检测 折叠 样品cDNA合成 折叠 样品 折叠 模板 折叠 PCR 折叠 引物列表 折叠 电泳

操作步骤

荧光定量PCR实验步骤:

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

1)紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A260下读值为1表示40μgRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260×稀释倍数×40μg/ml。具体计算如下:

RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21

RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl

取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为:

35μl×0.84μg/μl=29.4μg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2)变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度成分

0.4MMOPS，pH7.0

0.1M乙酸钠

0.01MEDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

②准备RNA样品

取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

③电泳

上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少23cm。

④紫外透射光下观察并拍照

28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

①反应体系

序号

反应物

剂量

1

逆转录buffer

2μl

2

上游引物

0.2μl

3

下游引物

0.2μl

4

dNTP

0.1μl

5

逆转录酶MMLV

0.5μl

6

DEPC水

5μl

7

RNA模版

2μl

8

总体积

10μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。

③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

管家基因(β-actin)实时定量PCR

①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为10，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为10，依次稀释至10、10、10、10、10、10，以备用。

②反应体系如下:

标准品反应体系

序号

反应物

剂量

1

SYBRGreen1染料

10μl

2

阳性模板上游引物F

0.5μl

3

阳性模板下游引物R

0.5μl

4

dNTP

0.5μl

5

Taq酶

1μl

6

阳性模板DNA

5μl

7

ddH2O

32.5μl

8

总体积

50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

管家基因反应体系:

序号

反应物

剂量

1

SYBRGreen1染料

10μl

2

内参照上游引物F

0.5μl

3

内参照下游引物R

0.5μl

4

dNTP

0.5μl

5

Taq酶

1μl

6

待测样品cDNA

5μl

7

ddH2O

32.5μl

8

总体积

50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为:93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。

反应体系:

序号

反应物

剂量

1

10×PCR缓冲液

2.5ul

2

MgCl2溶液

1.5ul

3

上游引物F

0.5ul

4

下游引物R

0.5ul

5

dNTP混合液

3ul

6

Taq聚合酶

1ul

7

cDNA

1ul

8

加水至总体积为

25ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟);72℃延伸5分钟。

②PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

③将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×10，依次稀释至10、10、10、10、10、10几个浓度梯度。

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。

体系配置如下:

序号

反应物

剂量

1

SYBRGreen1染料

10ul

2

上游引物

1ul

3

下游引物

1ul

4

dNTP

1ul

5

Taq聚合酶

2ul

6

待测样品cDNA

5ul

7

ddH2O

30ul

8

总体积

50ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。

②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，Z后72℃7分钟延伸。

引物设计软件:PrimerPremier5.0，并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

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