细胞实验中的肿瘤细胞体外传代培养及保种

一.细胞实验中的复苏与培养

将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃水浴，快速溶化，用8.0ml培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液，于1500转/分，离心3分钟。弃上清，再吸取8.0ml培养基质混匀细胞沉淀，再1500转/分，离心3分钟，弃上清，细胞沉淀用1.0ml培养基混匀，备用。另取一个75cm2方瓶，加入14.0ml培养基质，将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中，于37℃，5%CO2孵育箱中培养，后续再进行细胞实验。

若此肿瘤细胞悬浮生长，大约3－4天细胞基质会变黄，5.0ml细胞悬液可传代一个方瓶培养，可用3－4个方瓶培养，一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1-1.5×107个，根据试验所需，可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长，经过3-4天，肿瘤细胞生长至80%-95%单层时，弃上清，用0.5mM的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml)，处理肿瘤细胞大约3-5分钟，用倒置显微镜观察，当90%的肿瘤细胞变圆时，即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml离心管中，于1500转/分下，离心3分钟，弃上清，加少许培养基混匀，可传代3个75cm2方瓶扩大培养。

二.细胞实验中的细胞冻存

将对数生长的肿瘤细胞用1个75cm2方瓶按上述方法收集，于1500转/分离心3分钟，弃上清，用保种液(含10%DMSO的小牛血清)3.0ml混匀，分别加入到2-3只保种管中，写上肿瘤细胞名称、时间、保种者姓名，放-80℃保存，次日将它们转移到液氮中保存(注：-80℃下可保存细胞半年至一年，液氮可保存细胞5-10年，甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌(121℃，30分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)CJ，所有操作均必须遵守无菌操作技术，避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。

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