人羟脯氨酸（Hyp）酶联免疫分析试剂盒

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【导读】使用说明书仅供研究使用检测范围：156ng/ml-10000ng/ml最低检测限：39ng/ml预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中Hyp含量。概述:羟脯...

使用说明书仅供研究使用检测范围：156ng/ml-10000ng/mlZdi检测限：39ng/ml预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中Hyp含量。概述:羟脯氨酸（hydroxyproline），是亚氨基酸之一，通常在第四位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。自然界中不存在D-羟脯酸。在动物胶和骨胶原中含有L-羟脯氨酸。L-别羟脯氨酸是从鬼笔鹅膏（AmanitaPhalloides）中得到的有毒的多肽鬼笔环肽（phalloidine）的组成成分。一般的蛋白质不存在这种氨基酸。在自然界的羟脯氨酸的甲基衍生物中有左旋水苏碱、右旋水苏碱和γ-羟古液酸。在生物体内羟脯氨酸是由脯氨酸合成的,但不是以游离状态,而是在肽链中被羟基化。它的分解作用类似脯氨酸，但以带着羟基的状态进行,所以成为4-羟基谷氨酸。实验原理:用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗Hyp抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗Hyp抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的Hyp呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。组成及试剂配制:1.酶联板（Assayplate）：一块（96孔）。2.标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。3.样品稀释液（SampleDiluent）：1×20ml/瓶。4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibodyDiluent）：1×10ml/瓶。5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidinDiluent）：1×10ml/瓶。6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8.底物溶液（TMBSubstrate）：1×10ml/瓶。9.浓洗涤液（WashBuffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10.终止液（StopSolution）：1×10ml/瓶（2NH2SO4）。需要而未提供的试剂和器材:1.标准规格酶标仪2.高速离心机3.电热恒温培养箱4.干净的试管和Eppendof管5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，Z好用多通道移液器6.蒸馏水，容量瓶等标本的采集及保存:1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C1000xg离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000xg离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。注:标本溶血会影响Z后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。标本的稀释原则：首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。Z后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。标准品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10000ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释10000ng/ml，5000ng/ml，2500ng/ml，1250ng/ml，625ng/ml，312ng/ml，156ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15分钟内配制。如配制5000ng/ml标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10000ng/ml的上述标准品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。生物素标记抗体的稀释原则：临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记抗体加990μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。操作步骤:实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。注：1.用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。2.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是Z后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。3.为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。4.未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。5.建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。洗板方法:1.自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。2.手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。计算:以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。说明:1.试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。2.浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。3.中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。注意事项:1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2.洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3.一次加样时间Z好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4.请每次测定的同时做标准曲线，Z好做复孔。5.如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请Z后乘以稀释倍数。6.在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7.底物请避光保存。8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人Hyp，且与其他相关蛋白无交叉反应。有效期：6个月

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2004-11-23 09:23:22

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