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- 【导读】大鼠(Rat)胰岛素自身抗体(IAA)ELISA试剂盒实验操作说明书检测原理试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被胰岛素自身抗原的包被微孔中,依次加入标...
大鼠(Rat)胰岛素自身抗体(IAA)ELISA试剂盒实验操作说明书
检测原理
试剂盒采用双抗一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先
包被胰岛素自身抗原的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP
标记的检测抗原,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过
氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成Z终的黄色。
颜色的深浅和样品中的胰岛素自身抗体(IAA)呈正相关。用酶标仪
在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞
刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地
分离。
2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟
取上清。
5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于
-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1.酶标仪(450nm)
2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒温箱
操作注意事项
1.试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的
浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解
后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白,按照说明
书操作时样本已经稀释5倍,Z终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无
标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无
样本稀释液6mL3mL无
检测抗原-HRP10mL5mL无
20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释
底物A6mL3mL无
底物B6mL3mL无
终止液6mL3mL无
封板膜2张2张无
说明书1份1份无
自封袋1个1个无
注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、12.5、25、50、100、200μU/ml
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓
冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法
1.手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽
孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
2.自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封
袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.待测样本孔先加样本10μL,再加样本稀释液40μL(即样本稀释
5倍);空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶
(HRP)标记的检测抗原100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴
锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去
洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的
OD值。
结果判断
绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应
OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样
本浓度值。
试剂盒性能
1.准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于
0.9900。
2.灵敏度:Zdi检测浓度小于1.0μU/ml。
3.特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性:板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
6.有效期:6个月
免责声明
1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所
产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者
承担。
FORFORRESEARCHUSEONLY.
NOTFORUSEINDIAGNOSTICPROCEDURES.
Ratinsulinautoantibodies(IAA)ELISAKit
instruction
Intendeduse
ThisIAAELISAkitisintendedLaboratoryforResearchuseonlyandisnotforuse
indiagnosticortherapeuticprocedures.TheStopSolutionchangesthecolorfrom
bluetoyellowandtheintensityofthecolorismeasuredat450nmusinga
spectrophotometer.InordertomeasuretheconcentrationofIAAinthesample,this
IAAELISAKitincludesasetofcalibrationstandards.Thecalibrationstandards
areassayedatthesametimeasthesamplesandallowtheoperatortoproducea
standardcurveofOpticalDensityversusIAAconcentration.Theconcentrationof
IAAinthesamplesisthendeterminedbycomparingtheO.D.ofthesamplestothe
standardcurve.
Samplecollectionandstorages
Serum-Useaserumseparatortubeandallowsamplestoclotfor30minutes
beforecentrifugationfor10minutesatapproximately3000×g.Removeserumand
assayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeated
freeze-thawcycles
Plasma-CollectplasmausingEDTAorheparinasananticoagulant.Centrifuge
samplesfor30minutesat3000×gat2-8℃within30minutesofcollection.Store
samplesat-20℃or-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Cellculturesupernatesandotherbiologicalfluids-Removeparticulates
bycentrifugationandassayimmediatelyoraliquotandstoresamplesat-20℃or
-80℃.Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.
Note:Thesamples首lebecentrifugateddequatelyandnohemolysisor
granulewasallowed.
Materialsrequiredbutnotsupplied
1.Standardmicroplatereader(450nm)
2.PrecisionpipettesandDisposablepipettetips.
3.37℃incubator
Precautions
1.Donotsubstitutereagentsfromonekittoanother.Standard,conjugateand
microplatesarematchedforoptimalperformance.Useonlythereagentssuppliedby
manufacturer.
2.Donotremovemicroplatefromthestoragebaguntilneeded.Unusedstrips
首ldbestoredat2-8°Cintheirpouchwiththedesiccantprovided.
3.Mixallreagentsbeforeusing.
Removeallkitreagentsfromrefrigeratorandallowthemtoreachroomtemperature
(20-25°C)
Materialssupplied
Name96determinations48determinations
Microelisastripplate12*8strips12*4strips
Standard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubes
SampleDiluent6.0ml3.0ml
HRP-Conjugatereagent10.0ml5.0ml
20XWashsolution25ml15ml
ChromogenSolutionA6.0ml3.0ml
ChromogenSolutionB6.0ml3.0ml
StopSolution6.0ml3.0ml
Closureplatemembrane22
Usermanual11
Sealedbags11
Note:Standard(S0→S5)concentrationwasfollowedby:0,12.5,25,50,100,200
μU/ml
Reagentpreparation
20×washsolution:DilutewithDistilledordeionizedwater1:20.
Assayprocedure
1.Prepareallreagentsbeforestartingassayprocedure.Itisrecommendedthat
allStandardsandSamplesbeaddedinduplicatetotheMicroelisaStripplate.
2.Addstandard:SetStandardwells,testingsamplewells.Addstandard50μlto
standardwell.
3.AddSample:Addtestingsample10μlthenadd40μlofSampleDiluentto
testingsamplewell;Blankwelldoesn’taddanyting.
4.Add100μlofHRP-conjugatereagenttoeachwell,coverwithanadhesivestrip
andincubatefor60minutesat37°C.
5.Aspirateeachwellandwash,repeatingtheprocessfourtimesforatotaloffive
washes.Washbyfil领eachwellwithWashSolution(400μl)usingasquirtbottle,
manifolddispenserorautowasher.Completeremovalofliquidateachstepis
essentialtogoodperformance.Afterthelastwash,removeanyremainingWash
Solutionbyaspiratingordecanting.Inverttheplateandblotitagainstcleanpaper
towels.
6.AddchromogensolutionA50μlandchromogensolutionB50μltoeachwell.
Gentlymixandincubatefor15minutesat37°C.Protectfromlight.
7.Add50μlStopSolutiontoeachwell.Thecolorinthewells首ldchange
frombluetoyellow.Ifthecolorinthewellsisgreenorthecolorchangedoesnot
appearuniform,gentlytaptheplatetoensurethoroughmixing.
8.ReadtheOpticalDensity(O.D.)at450nmusingamicrotiterplatereader
within15minutes.
Calculationofresults
1.Thisstandardcurveisusedtodeterminetheamountinanunknownsample.
ThestandardcurveisgeneratedbyplottingtheaverageO.D.(450nm)
obtainedforeachofthesixstandardconcentrationsonthevertical(Y)axis
versusthecorrespondingconcentrationonthehorizontal(X)axis.
2.First,calculatethemeanO.D.valueforeachstandardandsample.AllO.D.
values,aresubtractedbythemeanvalueofthezerostandardbeforeresult
interpretation.Constructthestandardcurveusinggraphpaperorstatistical
software.
3.Todeterminetheamountineachsample,firstlocatetheO.D.valueonthe
Y-axisandextendahorizontallinetothestandardcurve.Atthepointof
intersection,drawaverticallinetotheX-axisandreadthecorresponding
concentration.
4.Anyvariationinoperator,pipettingandwashingtechnique,incubationtimeor
temperature,andkitagecancausevariationinresult.Eachuser首ldobtain
theirownstandardcurve.
5.Thesensitivitybythisassayis1.0μU/ml
6.Standardcurve
Storage:2-8℃.
validity:sixmonths.
FORRESEARCHUSEONLY;NOTFORTHERAPEUTICOR
DIAGNOSTICAPPLICATIONS!PLEASEREADTHROUGH
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- 2004-11-27 09:40:25
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