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- 【导读】WesternBlot印迹技术根据上海恒远了解。1975,EdwenSouthern提出分子印迹概念。概念:将存在于凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质上并加以检测分析的技术...
WesternBlot印迹技术
根据上海恒远了解。1975,EdwenSouthern提出分子印迹概念。
概念:将存在于凝胶中的生物大分子转移(印迹)于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA,RNA,蛋白质的检测。
蛋白质免疫印迹法
免疫印迹法(Westernblotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种Z常用的方法,如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。免疫印迹法(immunobiottingtest,IBT)亦称酶联免疫电转移印斑法(enzymelinkedimmunoelectrotransferblot,EITB),因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southernblot相类似,亦被称为Western-blot.
应用
1检测样品中特异蛋白存在与否
2细胞中特异蛋白的半定量分析
3蛋白质分子相互作用的研究
试剂准备1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2、匀浆缓冲液:1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml;10%SDS6.0ml;β-巯基乙醇0.2ml;ddH2O2.8ml。
3、转膜缓冲液:甘氨酸2.9g;Tris5.8g;SDS0.37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01MPBS(pH7.4):NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO41.44g;KH2PO40.24g;加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液:考马斯亮兰0.2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。
6、显色液:DAB6.0mg;0.01MPBS10.0ml;硫酸镍胺0.1ml;H2021.0μl。
操作步骤一蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。
二电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。
三转移:(半干式转移)
1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。
2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。
四免疫反应:
1、用0.01MPBS洗膜,5min×3次。
2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。
3、弃包被液,用0.01MPBS洗膜,5min×3次。
4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA,用0.01MPBS分别洗膜,5min×4次。
6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01MPBS稀释),平稳摇动,室温2hr。
7、弃二抗,用0.01MPBS洗膜,5min×4次。
8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
实验操作
1细胞裂解物的准备;
2细胞裂解物的蛋白定量;
3细胞裂解物的SDS-PAGE;
4蛋白质的转移;
6目的蛋白质的检测。
免疫印迹只能检测目的蛋白的相对含量
测定相对含量时,需要内参照
选择合适的反应条件:SDS-PAGE胶浓度;转移膜的选择;转移时间的选择
注意电极的正负极
抗体反应时,注意驱除反应袋内气泡
操作要轻柔。
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- 2004-11-29 09:23:26
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