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- 【导读】提起膜蛋白,浮现在广大从事蛋白研究的科研工作者脑海中的是两点:1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困难性。众所周知,膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性和运输方面都扮...
提起膜蛋白,浮现在广大从事蛋白研究的科研工作者脑海中的是两点:1.膜蛋白功能的重要性。2.膜蛋白研究的困难性。
众所周知,膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性和运输方面都扮演着重要的角色。由于它们功能多样,也就成为理想的药物靶点。然而,膜蛋白的生化和结构研究一直都很缓慢。ProteinDatabase的统计数据表明,在成功解析出三维结构的蛋白中,膜蛋白只占1%,这与膜蛋白占总蛋白的1/3的总量的差别巨大。由此也可以看出膜蛋白研究确实困难重重。
图1.利用QIAgenes优化序列,昆虫细胞体外进行膜蛋白表达。
由于膜蛋白的过表达可能对细胞有毒性,并且在纯化时很难选择合适的溶解试剂,再加上目前对膜蛋白晶体培养缺少有效方法和模型,所以要想顺利地获得膜蛋白的三维数据更是难上加难。幸亏技术总在进步,创新的产品也不断涌现。QIAGEN在2009年推出了膜蛋白的整体解决方案:QIAgenesExpressionKit-解决膜蛋白表达难题;Ni-NTAmembraneKit-GX率纯化重组膜蛋白;NeXtalCubicPhaseKit-轻松获得膜蛋白晶体不再是梦想。
利用EasyXpressInsectKitII,crudelysates(T),supernatant(S),andpelletfraction(P)bySDS-PAGEandwesternblottingusingPentaHisantibodies.Notethatmicrosomeswithintegratedmembraneproteinsarevisualizedinthepelletfraction(P)aftercentrifugationofthereaction.QIAgenesExpressionKit预制蛋白表达载体,可以帮你克服蛋白(包括膜蛋白)表达的难题。该预制表达载体采用Z先进的GeneOptimizer软件,对DNA序列进行以下方面的优化:稀有密码子,GC含量,ARG位点,可变剪切点,mRNA二级结构等因素进行优化,确保优化后的序列能在E.coli的体内,体外,真核细胞的体内或体外,以及哺乳动物细胞中进行GX表达。
成功表达了膜蛋白,接下来的挑战就是怎么分离出表达的膜蛋白。与可溶性蛋白不同,膜蛋白具有单重或多重跨膜结构容易发生聚集,导致膜蛋白很难溶解。目前常用的方法就是去污剂进行膜蛋白的溶解。去污剂同时具有疏水和亲水区域,和膜蛋白可以形成膜蛋白-去污剂的复合物,从而可以进行进一步的纯化。但是这里必须要指出的是,由于膜蛋白的种类不同,适合其溶解的去污剂类型也不一样,这就需要在溶解膜蛋白是筛选一系列的去污剂以获得Z佳的溶解效果。为了从事膜蛋白研究工作者的宝贵时间,QIAGEN推出了Ni-NTAMembraneProteinKit,专门用于带有His标签的重组膜蛋白的溶解和后续纯化。
Ni-NTAMembraneProteinKit有两部分组成,一部分是膜蛋白的溶解试剂,该部分包括7种Z常用的去污剂,用于供客户筛选Z适合自己的去污剂;另一部分是Ni-NTA纯化试剂,用于在膜蛋白溶解用,利用His标签和Ni-NTA的亲和特性进行进一步纯化。该试剂盒Zda的优势在于帮助膜蛋白研究者在Z短的时间筛选得到Zyou的去污剂,并且进行Ni-NTA纯化获得纯度高的膜蛋白。
图2.利用QIAGENNi-NTAmembraneKit筛选Z适合NhaA的去污剂类型。
实验结果表明,OG和NG不适合该膜蛋白的溶解,可以选择DM,LDA0,DDMCy6,和FOS进行NhaA溶解.M:His-taggedmarkerproteins。
图3.选择DDM进行NhaA的溶解,然后利用Ni-NTA进行纯化。
TP:totalprotein;SF:solublefraction;FT:flow-throughfraction;W:washfraction;E:eluate;M:markers.在成功的纯化得到膜蛋白后,如果想获得膜蛋白的三维结构,又要面临一个难题。据ProteinDataBase的统计数据表明,在成功解析出结构的蛋白中,膜蛋白只占了1%左右的比重。由此也可以看出,膜蛋白缺乏缺乏有效的结晶方法。目前常用脂立方相法建立膜蛋白的结晶实验。但是该方法存在以下局限性:1.步骤超多,建立实验过程非常复杂2.容易造成结晶孔间的交叉污染3.不适合高通量实验4.浪费膜蛋白。为了使膜蛋白的结晶成功率提高,QIAGEN开发出了NeXtalCubicPhaseKit。
NeXtalCubicPhaseKit之所以能够提高膜蛋白结晶的成功率,主要原因:1.采用NeXtalCubicPhaseμplate,这种结晶板修饰了monoolein(MO,用于建立脂立方相),另外这种结晶板具有非常好的光学特性,在可见光下就可以观测到膜蛋白晶体。2.采用专门的膜蛋白结晶溶液,QIAGEN专门开发出CubicPhaseI&IISuite用于膜蛋白结晶。NeXtalCubicPhaseKit非常适合高通量膜蛋白结晶。
图4.NeXtalCubicPhaseμplate结晶板,结晶孔修饰DMO。
图5.利用eXtalCubicPhaseCystallizationSystem成功进行了bacterio-rhodopsin(BR)结晶。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-11-29 09:23:27
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