组织一氧化氮（NO）活性荧光定量检测试剂盒

产品说明书
主要用途
组织一氧化氮（NO）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过硝酸还原酶反应系统产生的亚硝酸，使用荧光
探针二氨基萘，获得荧光化合物产物，通过荧光分光光度仪，来测定组织样品中总一氧化氮含量的权威而
经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、
昆虫等）的一氧化氮的总含量检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，敏感性强。
技术背景
一氧化氮（nitricoxide或nitrogenmonoxide；NO）由神经细胞、内皮细胞、血小板、中性白细胞和其它细胞
等产生的微量化学分子，作为第二信号分子，弥散穿过细胞膜，实施各种生物学功能。一氧化氮的过度生
成，将导致过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite）的形成、铁硫簇（iron-sulfurcluster）的破坏、巯基亚硝基化
（thiol-nitrosylation）和酪氨酸残基硝化（nitration），由此出现细胞损伤。一氧化氮的终端产物为硝酸（nitrate；
NO3－）和亚硝酸（nitrite；NO2－）。基于一氧化氮气体在液体中，容易转变成稳定且不挥发的硝酸和和亚硝
酸，因此硝酸和亚硝酸的浓度之和，可以准确反映一氧化氮的含量。使用NADH依赖性硝酸还原酶（nitrate
reductase；NaR），催化硝酸还原为亚硝酸的反应，进而通过荧光探针二氨基萘（2,3-diaminonaphthalene；
DAN），在酸性条件下，使亚硝酸转化为荧光性萘三唑（1-(H)-naphthotriazole），然后在碱性条件下，高度
增强荧光强度，由荧光分光光度仪检测，来定量分析一氧化氮的总含量，其反应方式为：
产品内容
清理液（ReagentA）毫升
裂解液（ReagentB）毫升
缓冲液（ReagentC）毫升
反应液（ReagentD）毫升
染色液（ReagentE）微升
稀释液（ReagentF）微升
强化液（ReagentG）微升
标准液（ReagentH）微升
产品说明书1份
保存方式
保存反应液（ReagentD）和染色液（ReagentE）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent
D）和染色液（ReagentE）避免光照；稀释液（ReagentF）和强化液（ReagentG）具有腐蚀性，注意操作
安全；有效保证6月
用户自备
2
15毫升锥形离心管：用于样品操作
1.5毫升离心管：用于制备样品和标准品的容器
微型台式离心机：用于样品处理
恒温水槽：用于反应孵育
酶标板或比色皿：用于荧光分析的容器
荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于样品荧光分析
实验步骤
实验开始前，设定好荧光分光光度仪或荧光酶标仪（温度为25℃）：激发波长360nm，散发波长450nm，
并置零。然后进行下列操作。
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重以确定200毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（ReagentA）清洗1次
4．移入到一个液氮冻存管
5．即刻放进液氮罐过一夜
6．次日从液氮罐里取出，即刻（Z快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7．放进一个15毫升锥形离心管
8．加入置于冰槽里的xx微升裂解液（ReagentB）
9．QL涡旋震荡30秒，充分混匀
10．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟QL涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱
里储存备用）
11．即刻放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为10000g
12．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
13．（选择步骤）即刻放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为100000g
14．（选择步骤）小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
15．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
16．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、标准样品配制
1．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
2．分别加入xx微升缓冲液（ReagentC）到2至5号管
3．移取xx微升标准液（ReagentH）到1号管
4．小心移取xx微升1号管的标准液（ReagentH）到2号管，混匀
5．小心移取xx微升2号管稀释的标准液（ReagentH）到3号管，混匀
6．小心移取xx微升3号管稀释的标准液（ReagentH）到4号管，混匀
7．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号缓冲液（ReagentC）标准液（ReagentH）标准一氧化氮浓度
1－xx微升xx微摩尔/升
3
2xx微升xx微升1号管xx微摩尔/升
3xx微升xx微升2号管xx微摩尔/升
4xx微升xx微升3号管xx微摩尔/升
5xx微升00
三、标准曲线测定
测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentE）在室温下融化，然后移出5微升染色液
（ReagentE）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（ReagentF），混匀后，标记为染色工作液，置
入暗室里。然后进行下列操作。
1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2．加入xx微升上述配制的标准液（ReagentH）
3．加入xx微升染色工作液
4．枪头抽吸数次，混匀
5．室温下，孵育10分钟
6．加入xx微升强化液（ReagentG）
7．室温下，孵育10分钟，避免光照
8．即刻放进荧光分光光度仪检测（激发波长360nm，散发波长450nm）：获得相对荧光单位（relative
fluorescenceunit；RFU）
9．重复实验步骤1至8四次
10．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准一氧化氮浓度（微摩尔/升）
四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿
2．加入20微升上述准备的待测样品（50微克蛋白）
3．加入xx微升反应液（ReagentD）
4．枪头抽吸数次，混匀
5．室温下孵育60分钟（注意：可以延长孵育至2小时）
6．加入xx微升染色工作液
7．枪头抽吸数次，混匀
8．室温下孵育10分钟
9．加入xx微升强化液（ReagentG）
10．室温下孵育10分钟，避免光照
11．即刻放进荧光分光光度仪检测（激发波长360nm，散发波长450nm）：获得相对荧光单位（relative
fluorescenceunit；RFU）
12．根据标准曲线获得样品对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
13．样品实际浓度计算：
五、酶标板测定
测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentE）在室温下融化，然后移出5微升染色液
4
（ReagentE）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（ReagentF），混匀后，标记为染色工作液，置
入暗室里。然后进行下列操作。
1．在96孔酶标板上做好相应标记：标准样品和待测样品
2．分别移取xx微升缓冲液（ReagentC）到所有孔中
3．分别加入xx微升上述配制的标准液（ReagentH）或待测样品（50微克蛋白）到相应孔里
4．分别加入xx微升反应液（ReagentD）到所有孔里
5．轻轻摇动96孔酶标板
6．室温下孵育60分钟（注意：可以延长孵育至2小时）
7．加入xx微升染色工作液到所有孔里
8．轻轻摇动96孔酶标板
9．室温下孵育10分钟
10．加入xx微升强化液（ReagentG）到所有孔里
11．轻轻摇动96孔酶标板
12．室温下孵育10分钟
13．即刻放进荧光酶标仪检测（激发波长360nm，散发波长450nm）：获得相对荧光单位（relativefluorescence
unit；RFU）
14．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位；横座标（X轴）为标准一氧化氮浓度（微摩尔/升）
15．根据标准曲线获得样品对应一氧化氮浓度（微摩尔/升）
16．样品实际浓度计算：
注意事项
1．本产品为50次操作，包括标准样品
2．操作时，须戴手套
3．本产品检测10纳摩尔至20微摩尔总一氧化氮
4．样品中避免含有各种还原性化学物质，包括巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（dithiothreitol；
DTT）、维生素C（ascorbicacid）和叠氮化钠（azide）等
5．稀释液（ReagentF）和强化液（ReagentG）具有腐蚀性，注意操作安全
6．如果用户没有特定波长的滤波器，可以使用激发波长360至375nm，散发波长415至450nm之间的任
一波长替代
7．荧光测定后，比色皿须清洗彻底
8．如果荧光读数过高，或超出仪器阈值，可以加入适量的无离子水稀释10至40倍再行测定
9．如果待测样品浓度过高或过低，可以增加或减少甚至稀释样品量
10．本公司提供系列一氧化氮分析试剂产品
质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

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