劲马解说:重组腺病毒构建,扩增及纯化基本技术操作

重组腺病毒构建,扩增及纯化基本技术操作

一目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）
1.选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。
2.重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。
3.重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。
4.用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。
5.胶回收线性化质粒，以备共转化使用。
二共转化
1大肠杆菌BJ5183电转感受态制备
从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。
接种25ml过夜培养物于500mlLB培养基，37℃振摇，至OD600达到0.4。
迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。
将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15min，弃培养液，回收细胞。
以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。
加约1ml（适量）预冷的10%甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ml（1.0OD600约2.5×1010个细胞/ml）。分装，-80℃或液氮保存待用。
2病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。
3将1-5l（约1g）线性化的穿梭质粒及1l（约100ng/l）病毒骨架质粒（如pAdEasy-1）加入至含约40lBJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。
4将混合物加入电转杯，电击（1250-1500V/mm,5ms）。
5电击结束取出样品，加入1mlSOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。
6取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培养16-20hr。
7次日挑取平板上长出的菌落（选择Z小的菌落）,接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。
8碱裂法提取质粒，0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段（约30kb）,及一条小片段（约3.0或4.5kb）（同时可进行其它酶切鉴定），则基本确定为阳性克隆。
9取1-5l阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞（BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒），扩增细菌并纯化质粒。
三重组病毒质粒转导293细胞
1293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×106293细胞于25cm2方瓶，使生长密度约50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）
2以PacI单酶切重组病毒质粒（转导25cm2方瓶约需4gDNA），完全线性化后，乙醇沉淀，再以20lddH2O溶解。
3脂质体包裹质粒（以Lipofectamine为例）:每4gPacI约需20lLipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500l无血清培养基再混合,置于室温下15-30min。
4以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。
5将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。
64hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6mlDMEM完全培养基（含10%FCS）。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6mlDMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。
7培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变（CPE）出现（如用pAdTrack-CMV质粒，由于含GFP，可观察到绿色荧光）。
四重组病毒鉴定
1转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。
2取30-50%步骤1中上清，感染50-70%饱和度的25cm2方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。
3感染后3-5d,当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Westernblot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。
4PCR鉴定重组病毒。取5l病毒上清加入10l蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2l作PCR。
五重组病毒扩增，纯化
175cm2方瓶中接种293细胞，至密度达到90%，加入适量病毒上清感染细胞。3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。
2以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次。4℃下7000g离心5min.病毒纯化至少需要30瓶75cm2方瓶细胞。
3CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4gCsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml。转移至12ml超速离心管（用于SW41转头）中，覆盖约2ml矿物油。平衡后，10℃下32000rpm离心18-24hr，用注射器抽吸离心出的病毒带。
（也可CsCl不连续梯度离心：20ml超速离心管中缓慢加入8mlCsCl1.4（53g+87mL10mMTris-HCl，pH=7.9），上面小心加入6mLCsCl1.2（26.8g+92mL10mMTris-HCl，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后，4℃下23000rpm离心90min（SW28转头），用注射器抽吸下层蓝白色病毒带）
4病毒透析去盐：配置透析液（10mMTrispH8.0,2mMMgCl2,5%sucrose），灭菌处理。4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。
六病毒滴度测定（TCID50）
1细胞准备:96孔板中接种100l293细胞,每孔细胞数约104个,以2%DMEM培养
2稀释病毒液准备：以2%DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度（如10-3-10-10），每个浓度重复10个，每孔加入病毒稀释液100l。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下，孵箱培养10天。
310d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率。（如某一浓度各孔细胞全部病变，比率为1，如无细胞病变，则比率为0）。
4计算T=10×101+d（S-0.5）/ml
d=Log10稀释度（如为10倍稀释℃，d=1）
S=各浓℃细胞病变比率之和
实验室重组腺病毒常用质粒：病毒骨架质粒：pAdEasy-1,pAdEasy-2
穿梭质粒：p-Shuttle,p-Shuttle-CMV,pAdTrack,pAdTrack-CMV

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