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- 【导读】 基因组DNA的纯化一般是通过裂解液处理样品,裂解细胞,将DNA从细胞核中释放出来,并使gDNA与蛋白质分开,DNA仍留在上清液中,通过后续的异丙醇沉淀将DNA沉淀分离出来...
基因组DNA的纯化一般是通过裂解液处理样品,裂解细胞,将DNA从细胞核中释放出来,并使gDNA与蛋白质分开,DNA仍留在上清液中,通过后续的异丙醇沉淀将DNA沉淀分离出来。
1、样品的收集和保存
请尽量使用新鲜的组织材料,采集样品如果不马上用于提取实验,请置于-20℃或者-70℃以下存放。期间应避免反复冻融,使用反复冻融或长时间未低温冷藏的样品进行DNA的提取,所提取的DNA片段可能不完整,或收获量低。对于较难破碎细胞壁的细菌和酵母细胞,应尽量收集处于生长对数期的菌体,以取得Z佳实验效果。
2、样品处理方式
样品材料进行破碎(及匀浆)可以提高裂解效率,组织破碎后可以充分与裂解液接触,利于裂解。不同来源的组织材料,根据组织成份的差异,样品处理的方式也有所差异。一般来说,样品的破碎方式,主要有液氮研磨、匀浆和蛋白酶K消化。
·细菌及酵母:细菌需要加入溶菌酶(Lysozyme)破碎细胞;酵母细胞需要加入溶壁酶(Lyticase)破碎细胞壁。
·动物组织:一般需要加入蛋白酶K消化的组织,无需液氮研磨、匀浆,尽量剪碎即可(如老鼠尾巴,加入蛋白酶K消化1-4小时即可)。充分破碎可以减少裂解时间,可使用玻璃匀浆器。
·植物组织:必须液氮研磨破碎。
3、DNA的洗脱
在低盐的条件下DNA可以很容易的从硅胶膜上洗脱下来,洗脱液的采用低盐缓冲液(10mMTris–HCL,pH8.5)。洗脱液pH值在7.0~8.5之间时,洗脱效率Zda,如果用ddH2O进行洗脱,请保证pH值在此范围内。
注:将洗脱缓冲液65℃预热,进行洗脱,将会提高洗脱效率。
4、DNA检测
纯化到的基因组DNA,OD260/OD280一般会在1.7~1.9之间,电泳检测时,电泳条带跟上样量以及琼脂糖凝胶浓度有很大关系,纯化到基因组DNA理想状态下为单一条带,但是往往由于提取过程中,操作等原因,电泳显示略有拖尾,属于正常现象。
5、DNA保存和稳定性
DNA分子在碱性条件下可以稳定存在,试剂盒所用洗脱液pH为8.5的缓冲液,可以稳定保存DNA分子。实验室所用ddH2O其pH值往往小于7.0,长时间保存,DNA容易发生降解。
长期保存时,应置于-20℃或-80℃,并且避免反复冻融。
原文地址:http://www.seekbio.com/biotech/exp/molbio/DNA/2011/a814131177.html
- 2004-07-25 09:29:07
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