植物基因组DNA的提取

一、材料

幼嫩叶子。

二、设备

移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂

1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/LTris·Cl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。

2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。

3、80：4：16/氯仿：戊醇：乙醇

4、RnaseA母液

5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。

四、操作步骤：

1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。

2.幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟（时间长,DNA产量高）,不时摇动。

3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀（需带手套,防止损伤皮肤），室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。

4.室温下5000rpm离心5分钟。

5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6.在1.5mleppendorf中加入1mlTE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9.加入5μlRNaseA（10μg/μl）,37℃10分钟,除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12.将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。

13.取2μlDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。

[注意]5g样品可保证获得500μgDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。

原文地址:http://www.seekbio.com/biotech/exp/molbio/DNA/2011/u81611945.html