色谱柱使用时的注意事项

正确使用和维护色谱柱非常重要。稍有疏忽会降低效率，缩短使用寿命甚至损坏色谱柱。在色谱操作过程中，需要注意以下问题以维护色谱柱。
①一般来说，色谱柱不能反吹。仅当制造商指示可以反吹色谱柱时，反吹才能清除残留在色谱柱头上的杂质。否则，反冲会迅速降低色谱柱效率。
②应逐渐改变溶剂的成分，尤其是在反相色谱法中，不应将其从有机溶剂直接改变为所有水，反之亦然。

③避免突然的压力和温度变化以及任何机械振动。温度的突然变化或色谱柱从高处掉落会影响色谱柱的填充条件；色谱柱压力的突然升高或降低也将推动色谱柱中的填料，因此在调节流速时以及在进样阀期间应缓慢进行。阀的旋转一定不能太慢（如上所述）。

④选择合适的流动相（尤其是pH），以避免破坏固定相。有时可以在采样器的前面连接一个预柱。当分析柱是键合硅胶时，预柱是硅胶，因此在进入分析柱之前，流动相可以用硅胶“饱和”，以防止分析柱中的二氧化硅基质溶解。

⑤避免将具有复杂基质的样品（尤其是生物样品）直接注入色谱柱中。必须对样品进行预处理或在进样器和色谱柱之间连接保护柱。保护柱通常是填充有相似固定相的短柱。保护柱可以并且应该经常更换。

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，以除去色谱柱中残留的杂质。清洁时，流动相在流路系统中的位移应与可混溶的溶剂逐渐过渡。每个流动相的体积应约为色谱柱体积的20倍，即常规分析需要50〜75ml。

以下是一些色谱柱清洗溶剂和顺序，以作为参考：硅胶柱依次用正己烷（或庚烷），二氯甲烷和甲醇洗涤，然后以相反顺序洗涤。所有溶剂必须严格脱水。甲醇可以洗掉剩余的强极性杂质，而己烷会重新活化硅胶表面。用水，甲醇，乙腈和一氯甲烷（或氯仿）依次洗涤反相柱，然后以相反顺序洗涤。如果在下一个分析中使用的流动相不包含缓冲液，则可以省略步骤*并用水冲洗。一氯甲烷可以洗掉剩余的非极性杂质。在甲醇（乙腈）冲洗过程中多次重复注射100〜200μl四氢呋喃有助于去除强疏水性杂质。四氢呋喃和乙腈或甲醇的混合溶液可以去除脂质。有时会注入几次二甲亚砜。此外，用乙腈，丙酮和三氟乙酸（0.1％）进行梯度洗脱可以去除蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液洗涤，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液洗涤以除去具有强交换性能的盐，然后用水，甲醇，二氯甲烷（除去有机物）依次吸附在固定相的表面上），甲醇和水。

在存储色谱柱时，请用乙腈或甲醇填充色谱柱，并拧紧色谱柱接头，以防止溶剂蒸发和干燥。 **请勿将缓冲溶液留在色谱柱中过夜或更长时间。

在使用⑧期间，如果压力升高，则可能是烧结过滤器堵塞。此时，应更换过滤器或将其取出进行清洁。另一种是大分子进入色谱柱。如果色谱柱效率降低或色谱峰变形，则色谱柱头可能会塌陷，死体积会增加。

发生后两种情况时，请小心地拧松色谱柱接头，使用干净的钢将色谱柱头填料取下1至2mm的高度（小心取出污染的填料），并在色谱柱中放平填料。然后，用固定有适当溶剂（与色谱柱中相同）浸润的固定相填充色谱柱，将其压平，然后拧紧色谱柱连接器。经过这种处理后，色谱柱的性能得到了改善，但是很难恢复到新色谱柱的水平。

列的故障通常是列的结尾。与分析柱固定相短的短柱（5〜30mm）安装在分析柱的前面，以保护并延长其寿命。保护柱的使用将失去一定的柱效，这是值得的。

通常，正确使用时，色谱柱寿命可以超过2年。基于硅胶的填充剂只能在2-9的pH范围内使用。色谱柱使用一段时间后，某些吸附力强的物质可能会残留在色谱柱的顶部，特别是一些有色物质，这些物质在吸附在色谱柱顶部的填料上更容易看到。在使用新的色谱柱一段时间后，色谱柱顶部的填料可能会塌陷，导致色谱柱效率降低。此时，还可以添加填料以恢复柱效。

每次工作后，使用具有较强洗脱能力的洗脱液进行洗涤。例如，ODS色谱柱应用甲醇洗涤至基准平衡。使用盐缓冲溶液作为流动相时，使用后请使用无盐流动相冲洗。含卤素元素（氟，氯，溴）的化合物可能腐蚀不锈钢管，并且不应长时间与其接触。如果不经常使用HPLC仪器上安装的色谱柱，则应每4至5天打开并冲洗15分钟。

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