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- 【导读】 色谱柱的正确使用和维护十分重要,稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱。 ① 一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以
正确使用和维护色谱柱非常重要。稍有疏忽会降低效率,缩短使用寿命甚至损坏色谱柱。在色谱操作过程中,需要注意以下问题以维护色谱柱。
①一般来说,色谱柱不能反吹。仅当制造商指示可以反吹色谱柱时,反吹才能清除残留在色谱柱头上的杂质。否则,反冲会迅速降低色谱柱效率。
②应逐渐改变溶剂的成分,尤其是在反相色谱法中,不应将其从有机溶剂直接改变为所有水,反之亦然。
③避免突然的压力和温度变化以及任何机械振动。温度的突然变化或色谱柱从高处掉落会影响色谱柱的填充条件;色谱柱压力的突然升高或降低也将推动色谱柱中的填料,因此在调节流速时以及在进样阀期间应缓慢进行。阀的旋转一定不能太慢(如上所述)。
④选择合适的流动相(尤其是pH),以避免破坏固定相。有时可以在采样器的前面连接一个预柱。当分析柱是键合硅胶时,预柱是硅胶,因此在进入分析柱之前,流动相可以用硅胶“饱和”,以防止分析柱中的二氧化硅基质溶解。
⑤避免将具有复杂基质的样品(尤其是生物样品)直接注入色谱柱中。必须对样品进行预处理或在进样器和色谱柱之间连接保护柱。保护柱通常是填充有相似固定相的短柱。保护柱可以并且应该经常更换。
⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱,以除去色谱柱中残留的杂质。清洁时,流动相在流路系统中的位移应与可混溶的溶剂逐渐过渡。每个流动相的体积应约为色谱柱体积的20倍,即常规分析需要50〜75ml。
以下是一些色谱柱清洗溶剂和顺序,以作为参考:硅胶柱依次用正己烷(或庚烷),二氯甲烷和甲醇洗涤,然后以相反顺序洗涤。所有溶剂必须严格脱水。甲醇可以洗掉剩余的强极性杂质,而己烷会重新活化硅胶表面。用水,甲醇,乙腈和一氯甲烷(或氯仿)依次洗涤反相柱,然后以相反顺序洗涤。如果在下一个分析中使用的流动相不包含缓冲液,则可以省略步骤*并用水冲洗。一氯甲烷可以洗掉剩余的非极性杂质。在甲醇(乙腈)冲洗过程中多次重复注射100〜200μl四氢呋喃有助于去除强疏水性杂质。四氢呋喃和乙腈或甲醇的混合溶液可以去除脂质。有时会注入几次二甲亚砜。此外,用乙腈,丙酮和三氟乙酸(0.1%)进行梯度洗脱可以去除蛋白质污染。
阳离子交换柱可用稀酸缓冲液洗涤,阴离子交换柱可用稀碱缓冲液洗涤以除去具有强交换性能的盐,然后用水,甲醇,二氯甲烷(除去有机物)依次吸附在固定相的表面上),甲醇和水。
在存储色谱柱时,请用乙腈或甲醇填充色谱柱,并拧紧色谱柱接头,以防止溶剂蒸发和干燥。 **请勿将缓冲溶液留在色谱柱中过夜或更长时间。
在使用⑧期间,如果压力升高,则可能是烧结过滤器堵塞。此时,应更换过滤器或将其取出进行清洁。另一种是大分子进入色谱柱。如果色谱柱效率降低或色谱峰变形,则色谱柱头可能会塌陷,死体积会增加。
发生后两种情况时,请小心地拧松色谱柱接头,使用干净的钢将色谱柱头填料取下1至2mm的高度(小心取出污染的填料),并在色谱柱中放平填料。然后,用固定有适当溶剂(与色谱柱中相同)浸润的固定相填充色谱柱,将其压平,然后拧紧色谱柱连接器。经过这种处理后,色谱柱的性能得到了改善,但是很难恢复到新色谱柱的水平。
列的故障通常是列的结尾。与分析柱固定相短的短柱(5〜30mm)安装在分析柱的前面,以保护并延长其寿命。保护柱的使用将失去一定的柱效,这是值得的。
通常,正确使用时,色谱柱寿命可以超过2年。基于硅胶的填充剂只能在2-9的pH范围内使用。色谱柱使用一段时间后,某些吸附力强的物质可能会残留在色谱柱的顶部,特别是一些有色物质,这些物质在吸附在色谱柱顶部的填料上更容易看到。在使用新的色谱柱一段时间后,色谱柱顶部的填料可能会塌陷,导致色谱柱效率降低。此时,还可以添加填料以恢复柱效。
每次工作后,使用具有较强洗脱能力的洗脱液进行洗涤。例如,ODS色谱柱应用甲醇洗涤至基准平衡。使用盐缓冲溶液作为流动相时,使用后请使用无盐流动相冲洗。含卤素元素(氟,氯,溴)的化合物可能腐蚀不锈钢管,并且不应长时间与其接触。如果不经常使用HPLC仪器上安装的色谱柱,则应每4至5天打开并冲洗15分钟。
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