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- 【导读】 前言本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:——修改了标准的中英文名称;——“第
- 前言本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》。本标准与GB/T 4789.3-2008相比,主要修改如下:——修改了标准的中英文名称;——“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU~150 CFU”;——删除了“第三法大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。食品安**家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。本标准适用于食品中大肠菌群的计数。2 术语和定义2.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2 *可能数most probable number,MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。3.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。3.3 恒温水浴箱:46 ℃±1 ℃。3.4 天平:感量0.1 g。3.5 均质器。3.6 振荡器。3.7 无菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶:容量500 mL。3.9 无菌培养皿:直径90 mm。3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。3.11 菌落计数器。4 培养基和试剂4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose,LST)肉汤:见附录A 中A.1。4.2 煌绿乳糖胆盐(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉汤:见附录A 中A.2。4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(Violet Red Bile Agar,VRBA):见附录A 中A.3。4.4 磷酸盐缓冲液:见附录A 中A.4。4.5 无菌生理盐水:见附录A 中A.5。4.6 无菌1 mol/L NaOH:见附录A 中A.6。4.7 无菌1 mol/L HCl:见附录A 中A.7。**法 大肠菌群MPN 计数法5 检验程序大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品:称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min 均质1 min~2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10 的样品匀液。6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10 的样品匀液。6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5~7.5 之间,必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头JD不要触及稀释液面),振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:100 的样品匀液。6.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次,换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min。6.2 初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1 mL,则用双料LST肉汤),36℃±1 ℃培养24 h±2 h,观察倒管内是否有气泡产生,24 h±2 h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续培养至48 h±2 h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。6.3 复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36 ℃±1℃培养48 h±2 h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。6.4 大肠菌群*可能数(MPN)的报告按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。第二法 大肠菌群平板计数法7 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。8 操作步骤8.1 样品的稀释按6.1进行。8.2 平板计数8.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。8.2.2 及时将15 mL~20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h。8.3 平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU~150 CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5 mm 或更大。8.4 证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落,分别移种于BGLB 肉汤管内,36 ℃±1 ℃培养24 h~48 h,观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。8.5 大肠菌群平板计数的报告经*后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1 mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。附录A(规范性附录)培养基和试剂A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g氯化钠 5.0 g乳糖 5.0 g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75 g磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75 g月桂基硫酸钠 0.1 g蒸馏水 1 000 mLpH 6.8±0.2A.1.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中,调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤A.2.1 成分蛋白胨 10.0 g乳糖 10.0 g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200 mL0.1%煌绿水溶液 13.3 mL蒸馏水 800 mLpH 7.2±0.1A.2.2 制法将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200 mL(将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975 mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL,用蒸馏水补足到1 000 mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)A.3.1 成分蛋白胨 7.0 g酵母膏 3.0 g乳糖 10.0 g氯化钠 5.0 g胆盐或3号胆盐 1.5 g中性红 0.03 g结晶紫 0.002 g琼脂 15 g~18 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.4±0.1A.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH。煮沸2 min,将培养基冷却至45 ℃~50 ℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3 h。A.4 磷酸盐缓冲液A.4.1 成分磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g蒸馏水 500 mLpH 7.2A.4.2 制法贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。A.5 无菌生理盐水A.5.1 成分氯化钠 8.5 g蒸馏水 1 000 mLA.5.2 制法称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。A.6 1 mol/L NaOHA.6.1 成分NaOH 40.0 g蒸馏水 1000 mLA.6.2 制法称取40 g氢氧化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。A.7 1 mol/L HClA.7.1 成分HCl 90 mL蒸馏水 1 000 mLA.7.2 制法移取浓盐酸90 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,121 ℃高压灭菌15 min。
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- 2007-04-12 11:57:40
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