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- 【导读】 α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响摘要:目的 探讨α7nACh 受体的竞争性拮抗剂(MLA) 对实验小鼠在Morris 水迷宫中学习记忆能力的影响。方法
- α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响摘要:目的 探讨α7nACh 受体的竞争性拮抗剂(MLA) 对实验小鼠在Morris 水迷宫中学习记忆能力的影响。方法 雄性昆明小鼠每天腹腔注射MLA (110、418μg/ g ) ,连续8d ,采用Morris 水迷宫,通过定位航行、空间探索试验观察分析小鼠的学习记忆能力。结果 小鼠腹腔注射MLA 418μg/ g 与其余三组相比,寻找平台潜伏期明显延长( P < 0101) ,在目标象限游泳时间所占百分比也明显降低( P < 0101) ,结论 腹腔注射MLA 418μg/ g的小鼠有学习和记忆能力的下降。关键词:α7nACh 受体的竞争性拮抗剂;Morris 水迷宫;学习记忆能力;小鼠α7nACh 受体的竞争性拮抗剂是燕草属植物飞燕草子(Delphinium spp1) 的提取物甲基牛扁亭(methyllycaconitine ,MLA) ,为一种植物毒素[1 - 2 ] 。近年来的动物实验研究表明, MLA 通过对α7nACh 受体的竞争性拮抗, 导致动物认知功能障碍[3 - 4 ] 。本实验采用腹腔注射法, 用Morris 水迷宫检测小鼠的学习记忆能力, 拟建立一种模拟α7nACh 受体损伤的痴呆模型, 以进一步为研究α7nACh 受体在阿尔茨海默病等退行性神经系统疾病的作用机理和针对ZLα7nACh 受体损伤的药物开发提供实验依据。1 材料和方法111 实验动物和分组 选用健康雄性3 个月龄昆明小白鼠(购自宁夏医学院实验动物ZX) 85 只,随机选取35 只用于确定*大逃逸潜伏期实验,其余50 只,在正式开始实验的前一天,小鼠依次在Morris 水迷宫中自由游泳2min ,选取游泳姿势和速度符合要求的小鼠40 只,随机分为4 组,每组各10 只。1) 正常对照组:小鼠自由进食饮水,自然昼夜节律光照;2) 生理盐水组:注射等量生理盐水;3) 110μg/ g组:每天注射MLA 110μg/ g ,连续8d ;4) 418μg/ g 组:每天注射MLA 418μg/ g ,连续8d。112 试剂和仪器 MLA:粉剂,购自Sigma 公司。Morris 水迷宫及微机生物机能系统,购自成都泰盟科技有限公司。113 MLA 溶液制备及给药剂量 临用前将110μg/ g 和418μg/ g 的MLA 分别溶解于生理盐水中,按011mL/ 10g 的剂量连续注射8d。114 Morris 水迷宫行为测定 水迷宫为圆形水池,池壁为乳白色,壁上标有东、南、西、北四个入水点,将水池等分为SW、MW、SE 及NE 四个象限,在SW象限正中放圆形透明平台,平台顶低于水面1cm ,水温(26 ±1) ℃,水中加入适量牛奶,至看不清水下平台。迷宫正上万悬挂摄像机并连接计算机等记录显示系统,实验期间保持环境安静,迷宫外参照物(如门、窗、冰箱、电灯) 等保持不变。11411 *大逃逸潜伏期的确定:选取的35 只小鼠,分上、下午两个时段进行水迷宫训练,每个时段训练4 次,训练时小鼠先自由游泳2min ,适应环境后将小鼠面向池壁放入水中,记录每次从入水点至找到平台的*大时限。训练时操作者随机选择一个入水点,但在同一个训练时段内,每只小鼠的入水点相同。120s 内找不到平台,将小鼠引导至平台上休息10s ,连续2d ,记录找到平台的时间。实验结束后,选取90 %以上小鼠找到平台的时间,确定为*大逃逸潜伏期。11412 注射MLA 动物定位航行试验(place navigation) :将筛选并分组的小鼠,从第1 天起,按11411 方法训练5d ,记录潜伏期及游泳速度,取后3d 的算术平均值进行统计分析。注射MLA 后按同样的方法继续训练,连续8d ,取8d 的算术平均值进行统计分析。11413 注射MLA 动物空间搜索试验( spatial probe test) :在训练第5d 和注射MLA 8d 后,撤除水下平台,于平台象限池壁中点为入水点,记录小鼠120s 内搜寻平台在各象限的游泳时间。115 统计学方法所有数据用(.x ±s) 表示,采用单因素方差分析(Oneway ANOVA) ,方差齐性时,用LSD(Le Significant Difference)或Student Newman Keuls 检验进行两两比较,方差不齐时,用秩和检验,组间比较Kruskal Wallisttest。采用SPSS 1110 统计软件对数据进行统计分析。2 结果211 *大潜伏期测定结果 35 只小鼠中,2 只原地打转,·190 ·宁夏医学院学报Journal of Ningxia Medical College第28 卷 3 期2006 年6 月不符合实验要求被剔除。33 只小鼠中有31 只经2d (16 次)训练,能够在第16 次训练后70s 以内找到平台,超过总数的90 % ,因此,确定*大潜伏期为70s。212 注射MLA 动物定位航行试验21211 逃逸潜伏期:训练5d 后,各组与正常对照组逃逸潜伏期比较差异无统计学意义( P > 0105) ; 注射MLA 后,418μg/ g 组和正常对照组比较逃逸潜伏期明显延长,有统计学意义( P < 0101) ,其余各组与正常对照组比较逃逸潜伏期差异无统计学意义( P > 0105) ,见表1。21212 游泳速度:训练5d 后和注射MLA 后,实验各组与正常对照组速度比较无统计学意义( P > 0105) ,提示注射生理盐水和MLA 后小鼠的运动能力没有受到影响(表1) 。表1 各组小鼠定位航行试验寻找隐匿平台的平均潜伏期和平均速度组别 潜伏期(s) 游泳速度(cm/ s)训练5d 注射MLA 8d 训练5d 注射MLA 8d正常对照 33.03 ±1.61 18.46 ±1.41 12.42 ±1.92 11.05 ±1.19生理盐水 32.68 ±4.99 17.11 ±1.45 11.12 ±1.29 11.84 ±4.03MLA 110μg/ g 31.54 ±4.99 15.11 ±1.46 13.09 ±3.21 10.56 ±1.59MLA 418μg/ g 29.65 ±5.34 47.95 ±9.313 11.21 ±1.35 10.13 ±0.59与对照组潜伏期比较3 P < 0101213 注射MLA 动物空间搜索试验 训练至第5d ,各组与正常对照组平台象限停留时间百分比比较无统计学意义( P > 0105) ;注射MLA 后,418μg/ g 组和正常对照组平台象限停留时间百分比比较有统计学意义( P < 0101) ,其余各组与正常对照组比较无统计学意义( P > 0105) ,见表2。表2 各组小鼠空间探索实验在目标象限所占时间百分比组别 平台象限停留时间百分比( %)训练5d 注射MLA 8d正常对照 45.12 47.61生理盐水 49.52 45.33MLA 110μg/ g 41.87 45.62MLA 418μg/ g 41.23 29.98*与对照组比较*P < 01013 讨论随着学习记忆脑机制研究的不断深入,以及寻找有效FZ认知障碍类疾病方法的需要,客观准确地评价实验动物的学习记忆水平已经成为神经生物学和神经药理学中非常重要的研究内容。Morris 水迷宫是英国心理学家Morris 于20 世纪80 年代初设计的,主要应用在学习记忆的神经生物学机制探讨和神经药理(包括中药药理) 的研究[5 ] 。但Morris 使用这一迷宫测试方法所针对的对象是大鼠,经过查阅资料发现亦有将之应用于小鼠的,但训练方法有所不同[6 - 8 ] ,在我们的测试中,训练为5 d ,分上、下午两个时段,每段训练4 次,实验至第3 天基本稳定,提示Morris 水迷宫也适用于小鼠的记忆行为测试。测试35 只小鼠,将*大潜伏期确定为70s ,在本实验中是比较合适的,既排除了因训练时间不同,而造成小鼠记忆能力的差异,也节省了时间,确保实验的完成。但由于训练的工作量大,工作人员少,测试的样本量较少,对于更准确地确定小鼠的*大潜伏期合适范围还需要进一步的研究。Morris 水迷宫的实验数据较为复杂,其统计分析难度也较大,尤其是小鼠在定位航行中所测得的逃避潜伏期如何进行统计学分析既往存在的问题较多。在本实验中,根据正常对照组的小鼠,通过5d 的训练期和8d 测试期,逃逸潜伏期逐渐减少,但在训练2d 后基本趋于稳定,因此,取后3d 的平均逃避潜伏期作为平均训练潜伏期进行统计分析。a7nACh 受体在阿尔茨海默病(AD) 的早期就有缺失,认为是AD 的早期症状,因此人们开始试图以a7nACh 受体为靶点,研究其结构、分布和功能与AD 的关系。但由于神经元烟碱受体( nAChR) 亚型之间差别很小,数量又很多,就α7nACh 受体亚型也不仅有种属差异,而且随年龄的变化而有改变,因此,要寻找α7nACh 受体亚型特异性拮抗剂或激动剂是非常艰难的,虽然近年来在合成竞争性特异性激动剂方面取得一些进展[9 ] ,但具有高亲和性特异性高的拮抗剂还是很少的,目前仅有a -bungarotoxin[10 ]和a - conotoxinI2mI and methyllycaconitine(MLA) [11 ] 。MLA 对哺乳类动物的神经型a7nACh 受体的亲和性比其它烟碱受体都要高。本实验中腹腔注射MLA 110 、418μg/ g 后,发现MLA 对小鼠的记忆有损害,且有剂量依赖性,提示可以通过选择适当剂量的MLA ,拟建立一种模拟a7nACh 受体靶点损伤的动物模型,为进一步研究α7nACh受体在AD 等神经系统退行性疾病的作用机理和针对ZLα7nACh 受体损伤的药物开发提供依据。α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响α7nACh 受体的竞争性拮抗剂对实验小鼠学习记忆能力的影响
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- 2007-07-10 14:17:31
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