饲料中的氨基酸 检测方法包

一.仪器及试剂

仪器：

1).天平一台（精度0.1mg）；

2).恒温水浴锅一台；

3).容量瓶；

4).试管（1.5×15cm或1.5×10cm）；

5).微量进样器（5ul或10µl）一支；

6).微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个；

7).旋涡混匀器一台；

8).HPLC系统及氨基酸分析专用柱（4.6×250mm）；

9).LC500梯度系统一台

试剂：

1).超纯水（≥18MΩ?cm）；

2).乙腈（HPLC级）；

3).三水合醋酸钠（分析纯）；

4).冰醋酸（分析纯）；

二：样品制备

准确称取饲料10-50mg，置于25mL具塞比色管中，加1.0mol/L盐酸10mL，搅拌提取15min，静置10分钟，将上清液过滤到100mL容量瓶中，残渣加1.0mol/L盐酸10mL，搅拌3min，重复提取两次，合并上清液，收集滤液并加1.0mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。

三.流动相的配制

流动相B：水：乙腈＝20：80

配制方法：准确量取水100ml和乙腈400ml，混合均匀，抽滤过0.45µm滤膜；

四.衍生化反应

1.对照品溶液的制备

17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。

17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，各氨基酸的浓度为：

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

Name

M.W.

C(mmol/L)

C(mg/ml)

门冬氨酸

谷氨酸

147.13

0.25

0.03678

缬氨酸

117.15

0.25

0.02929

丝氨酸

105.09

0.25

0.02627

蛋氨酸

149.21

0.25

0.03730

甘氨酸

75.067

0.25

0.01877

异亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

组氨酸

155.15

0.25

0.03879

亮氨酸

131.17

0.25

0.03279

精氨酸

174.20

0.25

0.04355

酪氨酸

181.19

0.25

0.04530

苏氨酸

119.12

0.25

0.02978

苯丙氨酸

165.19

0.25

0.04130

丙氨酸

89.093

0.25

0.02227

赖氨酸

146.19

0.25

0.03655

脯氨酸

115.13

0.25

0.02878

2.供试品溶液制备

精密量取/称取供试品适量，并配制成相应浓度的溶液备用。

3.衍生步骤

1）将恒温水浴锅预热至50±1℃；

2）分别将A、B两种衍生试剂用稀释剂稀释至原来浓度的1/5倍；

4）供试品的衍生步骤与对照品相同；

五.色谱条件

1.色谱柱：Ultimate®AA，5μm，4.6×250mm；

2.梯度程序：

流动相B：水：乙腈＝20：80

T(min)                   A%                        B%

0.01                    100.0                     0.0

11                       93.0                     7.0

13.9                     88.0                     12.0

14                       85.0                     15.0   

29                       66.0                     34.0

32                       30.0                    70.0

35                        0.0                   100.0

42                        0.0                   100.0

45                      100.0                     0.0  

60                      100.0                     0.0

流　速：1.0ml/min

柱　温：40℃

 波 长：254nm

 进样量：5μl

 工作站记录时间：60min

色谱图：

六.操作步骤和注意事项

1.操作步骤：

3）用乙腈：水＝20：80（A通道）冲洗系统20min，以防止缓冲盐析出；

4）A通道用流动相A排尽气泡，然后用流动相A走基线30min，平衡色谱柱；

5）运行一次空白梯度；

6）进样分析；

II）换90％乙腈冲洗色谱柱40min以上；

2.注意事项：

1）进样分析：先进对照品溶液，后进供试品溶液；

2）缓冲溶液，隔天需重新配制；

3）防止缓冲盐析出。

LC500液相色谱仪梯度系统一套

天平一台（精度0.1mg）

恒温水浴锅一台

容量瓶

试管（1.5×15cm或1.5×10cm）

微量进样器（100µl）一支

微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个

旋涡混匀器一台

HPLC2000色谱工作站

氨基酸分析专用柱（4.6×250mm）

超纯水（≥18MΩ?cm）

Welpure乙腈4*4L（HPLC级）

三水合醋酸钠（分析纯）

冰醋酸（分析纯）

Welpure正己烷4*4L（HPLC级）

衍生试剂A，1瓶，10ml/瓶

衍生试剂B，1瓶，10ml/瓶

氨基酸衍生试剂稀释剂，6瓶，10ml/瓶

氨基酸标准溶液，2瓶，1ml/瓶

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